本文關(guān)鍵詞：FMNL2通過(guò)COMMD10調(diào)控結(jié)直腸癌侵襲、轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制

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【摘要】：研究背景和目的結(jié)直腸癌是當(dāng)今最常見(jiàn)的疾病之一,全球每年有約120萬(wàn)名患者被確診為結(jié)直腸癌,而有超過(guò)60萬(wàn)名患者的直接或間接死因是結(jié)直腸癌。結(jié)直腸癌的疾病分期是最重要的預(yù)后因素,I期患者的5年生存率可達(dá)90%以上,而Ⅳ期患者只有略大于10%的生存率，，轉(zhuǎn)移是影響結(jié)直腸癌患者療效和死亡的主要原因,因此闡明結(jié)直腸癌發(fā)生轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制,對(duì)于降低死亡率和提高治愈率具有重大的科學(xué)意義。FMNL2是本課題組前期篩選出來(lái)的在結(jié)直腸癌細(xì)胞株和組織中表達(dá)上調(diào)的基因,它與結(jié)直腸癌發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān),并促進(jìn)結(jié)直腸癌細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)、侵襲和轉(zhuǎn)移。此外,課題組對(duì)FMNL2調(diào)控結(jié)直腸癌侵襲和轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制進(jìn)行了探討,結(jié)果顯示：FMNL2能通過(guò)誘導(dǎo)上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化促進(jìn)結(jié)直腸癌細(xì)胞發(fā)生轉(zhuǎn)移,HMGA1/miR-137/FMNL2軸也參與結(jié)直腸癌侵襲和轉(zhuǎn)移。在前期,我們利用酵母雙雜交篩選FMNL2相互作用蛋白,其中COMMD10蛋白的結(jié)合的特異性較強(qiáng)。COMMD10是COMMD蛋白家族中的一員,COMMD蛋白是最近發(fā)現(xiàn)的一個(gè)蛋白家族,其特征是具有一個(gè)COMMD結(jié)構(gòu)域。COMMD蛋白參與調(diào)控多種生物學(xué)過(guò)程如銅和鈉運(yùn)輸、細(xì)胞增殖及對(duì)缺氧的適應(yīng)等。目前有關(guān)COMMD家族與腫瘤的研究報(bào)道較少,僅有6篇文獻(xiàn)。研究發(fā)現(xiàn)COMMD1常在人類癌癥中表達(dá)下調(diào),COMMD1的表達(dá)下調(diào)能促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移；此外COMMD1能抑制轉(zhuǎn)錄因子NF-κB的活性。COMMD5在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤、腎細(xì)胞癌、肝細(xì)胞癌細(xì)胞株及組織中的表達(dá)明顯下調(diào),該基因可能參與腫瘤的細(xì)胞周期調(diào)控,COMM5轉(zhuǎn)染人胚胎腎HEK293細(xì)胞后,細(xì)胞的增殖能力下降,細(xì)胞周期出現(xiàn)G2/M期阻滯,并伴有p21cipl/WhFl表達(dá)下調(diào)及p27KIPI下調(diào)。Gkiafi等利用比較蛋白組學(xué)方法篩選出7個(gè)COMMD蛋白是BL41Burkitt's淋巴瘤細(xì)胞株中EB病毒作用的靶點(diǎn)。凝集素通過(guò)與SCF-βTrCP E3連接酶相互作用,促進(jìn)COMMD1和IκB蛋白降解,從而增強(qiáng)前列腺癌細(xì)胞的NF-κB活性。目前尚未有COMMD10與腫瘤的研究報(bào)道。本研究對(duì)FMNL2相互作用蛋白COMMD10進(jìn)行驗(yàn)證,明確COMMD10在FMNL2調(diào)控結(jié)直腸癌侵襲和轉(zhuǎn)移中的作用,并進(jìn)一步探討了FMNL2通過(guò)COMMD10調(diào)控NF-kB通路的分子機(jī)制,旨在揭示FMNL2參與結(jié)直腸癌轉(zhuǎn)移的新機(jī)制,為臨床腫瘤轉(zhuǎn)移干預(yù)及藥物研制提供潛在治療新靶點(diǎn)。研究方法1. FMNL2與COMMD10相互作用鑒定(1)利用免疫共沉淀(Co-IP)及熒光共聚焦檢測(cè)FMNL2和COMMD10抗體的結(jié)合情況；(2)構(gòu)建GST-COMMDIO截短子原核表達(dá)載體,利用GST-pull down實(shí)驗(yàn)和CO-IP實(shí)驗(yàn)明確FMNL2 (FLAG-FMNL2截短子真核表達(dá)載體前期由本課題組喬玉丹博士構(gòu)建完成)與COMMD10相互作用結(jié)構(gòu)域。(3)收集SW480/FMNL2、SW620/siFMNL2細(xì)胞的RNA和蛋白,利用熒光定量PCR及Western blot檢測(cè)COMMD10表達(dá)量的變化；利用陽(yáng)離子脂質(zhì)體法將COMMD10過(guò)表達(dá)載體瞬時(shí)轉(zhuǎn)染至SW480、SW620細(xì)胞株中,siCOMMD10干擾片段瞬時(shí)轉(zhuǎn)染至SW480、HT29中,收集這四株細(xì)胞株的RNA和蛋白,利用熒光定量PCR及Western blot檢測(cè)FMNL2表達(dá)量的變化。2. COMMD10抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移(1)利用熒光定量PCR及Western blot在6株結(jié)直腸癌細(xì)胞株中篩選出COMMD10內(nèi)源性表達(dá)量最高、最低及居中的3株結(jié)直腸癌細(xì)胞株。(2)構(gòu)建pEGFP-C1-COMMD10過(guò)表達(dá)載體,利用陽(yáng)離子脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染至結(jié)直腸癌細(xì)胞株SW480及SW620細(xì)胞中,利用熒光定量PCR以及Western blot鑒定轉(zhuǎn)染效率。(3)利用陽(yáng)離子脂質(zhì)體法,將3個(gè)商品化的siCOMMD10片段瞬時(shí)轉(zhuǎn)染至結(jié)直腸癌細(xì)胞株SW480及HT29中,利用熒光定量PCR及Western blot鑒定干擾效率。設(shè)計(jì)并構(gòu)建COMMD10慢病毒干擾載體,由公司進(jìn)行慢病毒上清的包裝,并感染至結(jié)直腸癌細(xì)胞株SW480、HT29中,應(yīng)用流式分選技術(shù)篩選穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株,利用熒光定量PCR及Western blot技術(shù)驗(yàn)證穩(wěn)定株中COMMD10的干擾效率。(4)利用CCK8、Boyden小室侵襲實(shí)驗(yàn)、平板克隆形成實(shí)驗(yàn)、細(xì)胞周期、細(xì)胞凋亡檢測(cè)COMMD10過(guò)表達(dá)和干擾后對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞株體外生物學(xué)行為的影響。(5)利用SPF級(jí)BALB/c裸鼠動(dòng)物模型,觀察COMMD10干擾后對(duì)裸鼠皮下成瘤及尾靜脈體內(nèi)轉(zhuǎn)移能力的影響。(6)收集31對(duì)新鮮結(jié)直腸癌組織及癌旁組織,利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)COMMD10的表達(dá)情況,并隨機(jī)選取其中10對(duì)配對(duì)組織進(jìn)行Western Blot檢測(cè)COMMD10在癌組織和癌旁組織中的表達(dá)情況。(7)免疫組化檢測(cè)120例結(jié)直腸癌患者的石蠟切片中COMMD10的表達(dá)情況,并分析其與臨床病理聯(lián)系。3. FMNL2通過(guò)COMMD10調(diào)控[NF-κB信號(hào)通路,從而促進(jìn)結(jié)直腸癌侵襲和轉(zhuǎn)移(1)利用雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)檢測(cè)COMMD10對(duì)NF-κB轉(zhuǎn)錄活性的影響。(2)利用Western blot檢測(cè)COMMMD10對(duì)NF-κB通路的影響。(3) Western blot檢測(cè)FMNL2通過(guò)COMMD10對(duì)NF-κB信號(hào)通路的影響。(4)構(gòu)建FMNL2/COMMD10共表達(dá)和共干擾的細(xì)胞株,通過(guò)CCK8實(shí)驗(yàn)、Boyden小室侵襲實(shí)驗(yàn)、裸鼠皮下成瘤和體內(nèi)轉(zhuǎn)移實(shí)驗(yàn)觀察COMMD10對(duì)FMNL2在結(jié)直腸癌中生物學(xué)行為的逆轉(zhuǎn)作用。研究結(jié)果1.FMNL2-與COMMD10相互作用研究(1)利用CO-IP實(shí)驗(yàn)檢測(cè)SW480、HCT116細(xì)胞中FMNL2與COMMD10結(jié)合情況,結(jié)果顯示：FMNL2與COMMD10存在直接結(jié)合作用。(2)利用激光共聚焦顯微鏡觀察SW480、HCT116細(xì)胞中FMNL2與COMMD10共定位情況,結(jié)果顯示：FMNL2與COMMD10共定位于細(xì)胞胞漿中。(3)成功構(gòu)建了COMMD10截短子原核表達(dá)載體：pGEX-6p-1-COMMD10 (1-132a)、pGEX-6p-1-COMMD10 (133-202a);成功表達(dá)了GST融合蛋白：GST-COMMD10 (1-132a)、GST-COMMD10 (133-202a)。GST-pull down結(jié)果顯示,COMMD10 (1-132a)能與FMNL2直接結(jié)合：CO-IP實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：FMNL2 (525-616a)與COMMD10直接結(jié)合。(4)收集FMNL2或COMMD10過(guò)表達(dá)和干擾細(xì)胞株RNA和蛋白,熒光定量PCR結(jié)果顯示,與對(duì)照組相比,SW480/FMNL2細(xì)胞株中COMMD10的表達(dá)量明顯下調(diào)(t=29.358, p0.001); SW480/siFMNL2、SW620/siFMNL2細(xì)胞株中COMMD10的表達(dá)量明顯高于對(duì)照組(t=-8.436, p0.05; t=-5.511,p 0.05); Western blot結(jié)果與Q-PCR結(jié)果一致,說(shuō)明FMNL2可以負(fù)向調(diào)控COMMD10的表達(dá)。在SW480/COMMD10、SW620/COMMD10細(xì)胞株中FMNL2的表達(dá)量與對(duì)照組相比無(wú)顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(t=-0.338, p0.05; t=2.366, p 0.05);在SW480/siCOMMD10. HT29/siCOMMD10細(xì)胞中FMNL2的表達(dá)量與對(duì)照組相比無(wú)顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(t=-1.517, p0.05; t= 0.547, p0.05); Western blot結(jié)果與Q-PCR結(jié)果一致,說(shuō)明COMMD10不能調(diào)控FMNL2的表達(dá)。2. COMMD10抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移2.1COMMD10在結(jié)直腸癌中生物學(xué)特性的研究2.1.1 COMMD10在結(jié)直腸癌細(xì)胞中的表達(dá)驗(yàn)證(1) Western blot和real-time-PCR結(jié)果顯示,COMMD10的表達(dá)在6種結(jié)直腸癌細(xì)胞株間的表達(dá)具有顯著差異(F=131.316,p0.001); COMMD10在HT29細(xì)胞中的表達(dá)最高,且顯著高于LS174T、SW480、HCT116、 SW620、 LoVo細(xì)胞中的表達(dá)(p0.001,p0.001,p0.001,p0.001); COMMD10在SW620細(xì)胞中的表達(dá)最低,且明顯低于HT2、LS174T、SW480、HCT116細(xì)胞中的表達(dá)(p0.001, p0.001, p0.001, p0.001);(2)利用陽(yáng)離子脂質(zhì)體法,將COMMD10質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至結(jié)直腸癌細(xì)胞株SW480及SW620細(xì)胞中,熒光定量PCR及Western blot檢測(cè)發(fā)現(xiàn)：以各自細(xì)胞MOCK組為對(duì)照,獨(dú)立樣本T檢驗(yàn)分析顯示,過(guò)表達(dá)組COMMD10的表達(dá)量明顯增加(t=-4.756, p=0.017; t=-466.661, p=0.015).(3)將siCOMMD10瞬時(shí)轉(zhuǎn)染至HT29、SW480細(xì)胞中,熒光定量PCR和Western blot檢測(cè)COMMD10的表達(dá)。Q-PCR結(jié)果顯示,COMMD10-siRNA-1/-2/-3瞬時(shí)轉(zhuǎn)染至細(xì)胞后COMMD10-mRNA水平顯著降低(p0.001, p0.001,p0.001, p0.001, p0.001, p0.001), Western blot結(jié)果與Q-PCR結(jié)果一致,si-1/-2/-3均為有效干擾序列,且干擾效率間無(wú)明顯差異(p0.05, p0.05, p0.05,p0.05, p0.05, p0.05)。選擇sil構(gòu)建SW480/siCOMMD10、HT29/siCOMMD10穩(wěn)定株,利用熒光定量PCR和Western blot檢測(cè)COMMD10的表達(dá),獨(dú)立樣本T檢驗(yàn)分析顯示,與NC組相比,干擾組中COMMD10-mRNA表達(dá)明顯降低(t=10.457, p0.001;t=9.198, p0.001)。2.1.2 COMMD10結(jié)直腸癌細(xì)胞體外生物學(xué)行為的影響(1)利用CCK8實(shí)驗(yàn)觀察COMMD10過(guò)表達(dá)或者干擾對(duì)細(xì)胞體外增殖能力的影響,同時(shí)繪制生長(zhǎng)曲線。析因方差分析結(jié)果顯示：在過(guò)表達(dá)組,SW480、 SW620細(xì)胞生長(zhǎng)時(shí)間水平具有顯著差異性(F=304.467, p0.001; F= 1874.713,p0.001),細(xì)胞增殖能力組間具有顯著差異性(F=133.700,p0.001;F= 753.713, p0.001),時(shí)間與分組之間的交互效應(yīng)顯著性(F=24.504,p0.001; F= 102.071,p0.001);在干擾組中,SW480、HT29細(xì)胞生長(zhǎng)時(shí)間水平具有顯著差異性(F=612.674, p0.001; F= 505.402,p0.001),細(xì)胞增殖能力組間具有顯著差異性(F=110.541,p0.001; F= 966.668,p0.001),時(shí)間與分組之間的交互效應(yīng)顯著性(F= 15.385,p0.001; F= 71.803,p0.001)。結(jié)果表明,與MOCK組相比,COMMD10過(guò)表達(dá)組的增殖速度明顯減慢：與NC組相比,COMMD10干擾組增殖速度明顯增加。(2)利用平板克隆形成實(shí)驗(yàn)觀察SW480/NC和SW480/siCOMMD10細(xì)胞體外增殖能力的變化,兩獨(dú)立樣本T檢驗(yàn)統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示,與NC組相比,COMMD10干擾組的增殖能力明顯增加(t=-10.124,p0.001)。(3)用流式細(xì)胞儀檢測(cè)COMMD10對(duì)細(xì)胞周期的影響,獨(dú)立樣本T檢驗(yàn)結(jié)果顯示：SW480/COMMD10組與SW480/MOCK組相比,G1期的細(xì)胞比例明顯增加(t=-20.145,p0.001)；S期的細(xì)胞比例明顯減少(t=11.248,p0.001)；G2/M期的細(xì)胞比例明顯增加(t=4.794, P=0.009); SW480/siCOMMD10組與SW480/NC組相比,G1期的細(xì)胞比例明顯減少(t-7.303,p=0.002)；S期的細(xì)胞比例明顯增加(t=-4.003, p=0.016);G2/M期的細(xì)胞比例明顯減少(t=-4.825,p＝0.035)；提示COMMD10能抑制癌細(xì)胞從G1向S期演進(jìn),從而抑制細(xì)胞增殖能力。(4)利用流式細(xì)胞儀檢測(cè)COMMD10對(duì)細(xì)胞凋亡的影響,獨(dú)立樣本T檢驗(yàn)結(jié)果顯示：過(guò)表達(dá)COMMD10后,發(fā)生早期凋亡的細(xì)胞數(shù)目明顯增加(t=-7.821,p=0.013)；干擾COMMD10后,發(fā)生早期凋亡的細(xì)胞數(shù)目明顯減少(t=7.917,p=0.001),說(shuō)明COMMD10能促進(jìn)結(jié)腸癌細(xì)胞凋亡。(5)利用Boyden小室觀察COMMD10過(guò)表達(dá)或者干擾后,結(jié)直腸癌細(xì)胞的體外侵襲能力的變化。兩獨(dú)立樣本T檢驗(yàn)分析結(jié)果顯示,與MOCK組相比,SW620/COMMD10組與SW480/COMMD10細(xì)胞穿過(guò)膜的細(xì)胞數(shù)目明顯減少(t=8.944, p0.001;t=5.785, p0.001),與NC組相比,SW480/siCOMMD10與HT29/siCOMMD10組穿過(guò)膜的細(xì)胞數(shù)目明顯增多(t=-7.019,p0.001; t=-9.477, p0.001),表明COMMD10抑制腫瘤細(xì)胞的體外侵襲能力。2.1.3 COMMD10結(jié)直腸癌細(xì)胞體內(nèi)生物學(xué)行為的影響利用SW480/NC、SW480/siCOMMD10細(xì)胞株進(jìn)行裸鼠皮下成瘤和尾靜脈注射體內(nèi)轉(zhuǎn)移實(shí)驗(yàn)。皮下腫瘤經(jīng)兩獨(dú)立樣本T檢驗(yàn),結(jié)果顯示：COMMD10干擾組的皮下腫瘤重量明顯高于NC組(t=-7.166,p0.001)。裸鼠的尾靜脈體內(nèi)轉(zhuǎn)移實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：兩組細(xì)胞均在肺臟表面可見(jiàn)明顯的轉(zhuǎn)移灶,SW480/NC組中裸鼠出現(xiàn)肺臟轉(zhuǎn)移率為80%(4/5)；SW480/SiCOMMD10組中裸鼠出現(xiàn)肺臟轉(zhuǎn)移率為100%(5/5)。以上結(jié)果顯示：COMMD10抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞株的體內(nèi)成瘤及轉(zhuǎn)移能力。2.1.4 COMMD10在結(jié)直腸癌中的表達(dá)及與臨床病理聯(lián)系(1)利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)了31對(duì)新鮮結(jié)直腸癌組織及遠(yuǎn)端正常組織COMMD10的表達(dá),結(jié)果顯示COMMD10在結(jié)直腸癌組織中的表達(dá)明顯低于正常粘膜組織(t=5.226,p0.001)；隨機(jī)選取其中10對(duì)配對(duì)組織進(jìn)行Western Blot檢測(cè)發(fā)現(xiàn)COMMD10在癌組織中的表達(dá)明顯低于癌旁組織。(2)免疫組化檢測(cè)120例結(jié)直腸癌病人的石蠟切片中COMMD10的表達(dá)情況,臨床病理分析結(jié)果顯示：COMMD10與患者年齡、腫瘤、分化程度、浸潤(rùn)深度、腫瘤的大小以及腫瘤Dukes分期均無(wú)顯著關(guān)系(p0.05, p0.05, p 0.05, p0.05, p0.05);與有無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移上存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p=0.013,p=0.014)。3.FMNL2通過(guò)COMMD10調(diào)控NF-κB信號(hào)通路,從而促進(jìn)結(jié)直腸癌細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移3.1COMMD10抑制NF-κB信號(hào)通路激活(1)以商品化NF-κB為熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)表達(dá)載體,利用熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)檢測(cè)COMM10對(duì)NF-κB轉(zhuǎn)錄活性的影響。結(jié)果顯示：在SW480細(xì)胞中,以MOCK組為對(duì)照,COMMD10組熒光素酶活性顯著降低(p0.05,p0.05),加入TNF-α處理后,熒光素酶活性明顯增加(p0.001,p0.05)；與單純加入TNF-α處理組相比,同時(shí)轉(zhuǎn)染了COMMD10和加入TNF-α處理后,熒光素酶活性顯著下降(p0.001,p0.05)；以NC組為對(duì)照,siCOMMD10組熒光素酶活性顯著增加(p0.001,p0.001),siCOMMD10組與同時(shí)轉(zhuǎn)染了siCOMMD10和κλBα-mut組(IκBα的負(fù)性突變體,為NF-κB信號(hào)通路的抑制劑)相比,熒光素酶活性明顯下降(p0.001；p0.001)說(shuō)明COMMD10能夠抑制NF-κB的轉(zhuǎn)錄活性。(2) Western blot檢測(cè)NF-κB信號(hào)通路蛋白的表達(dá)變化,結(jié)果顯示：在SW480細(xì)胞中,以MOCK組為對(duì)照,加入TNF-α刺激后,p-IKKα/β、p-IκBα、細(xì)胞核內(nèi)p65表達(dá)上調(diào)；IKKα/β、IκBα、胞漿內(nèi)p65表達(dá)下調(diào),而加入TNF-α刺激的同時(shí)過(guò)表達(dá)COMMD10發(fā)現(xiàn)p-IKKα/β、p-IκBα、細(xì)胞核內(nèi)p65表達(dá)出現(xiàn)下調(diào),IKKα/β、IκBα、胞漿內(nèi)p65表達(dá)上調(diào)。在SW480細(xì)胞中,以NC組為對(duì)照,干擾COMMD10后p-IKKα/β、p-IκBα、細(xì)胞核內(nèi)p65表達(dá)上調(diào),IKKα/β、IκBα、胞漿內(nèi)p65表達(dá)下調(diào),而干擾COMMD10的同時(shí)加入IκBα-mut后,p-IKKα/β、 p-IκBα、細(xì)胞核內(nèi)p65表達(dá)出現(xiàn)下調(diào),IKKα/β、IκBα、胞漿內(nèi)p65表達(dá)上調(diào)。以上結(jié)果說(shuō)明COMMD10能夠抑制NF-κB信號(hào)通路的激活。3.2 FMNL2通過(guò)COMMD10影響NF-κB信號(hào)通路激活利用Western blot檢測(cè)SW480/MOCK、SW480/FMNL2、 SW480/FMNL2/COMMD10細(xì)胞和SW620/NC、SW620/siFMNL2、 SW620siFMNL2/siCOMMD10細(xì)胞中NF-κB信號(hào)通路蛋白表達(dá)變化,結(jié)果顯示：SW480/FMNL2與SW480/MOCK相比,SW480/FMNL2細(xì)胞中p-IKKα/β、 p-IκBα、細(xì)胞核內(nèi)p65表達(dá)上調(diào),IKKα/β、IκBα、胞漿內(nèi)p65表達(dá)下調(diào)；SW480/FMNL2/COMMD10與SW480/FMNL2相比,SW480/FMNL2/COMMD10細(xì)胞中p-IKKα/β、p-IκBα、細(xì)胞核內(nèi)p65表達(dá)下調(diào),IKKα/β、 IκBα、胞漿內(nèi)p65表達(dá)上調(diào)；說(shuō)明FMNL2通過(guò)COMMD10影響NF-κB信號(hào)通路激活。3.3 FMNL通過(guò)COMMD10調(diào)控結(jié)直腸癌侵襲和轉(zhuǎn)移(1)CCK8實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：以SW480/MOCK為對(duì)照,SW480/FMNL2的體外增殖速度明顯增加(p0.001); SW480/FMNL2/COMMD10與SW480/FMNL2相比,S W480/FMNL2/COMMD10體外增殖速度明顯下降(p0.001)；在SW620細(xì)胞中,以NC組為對(duì)照,siFMNL2組的增殖速度明顯下降(p0.001),而siFMNL2/siCOMMD10組能有效逆轉(zhuǎn)這種抑制作用(p0.001)。說(shuō)明COMMD10能夠抑帶FMNL2的體外促細(xì)胞增殖能力。(2) Boy den小室侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：在SW480細(xì)胞株中,與MOCK組對(duì)比,FMNL2組侵襲到下室的細(xì)胞數(shù)目明顯增多(p0.001),表明FMNL2能促進(jìn)細(xì)胞侵襲能力,而FMNL2/COMMD10組能有效減弱了FMNL2的促侵襲能力(p0.001)；在SW620細(xì)胞株中,以NC組為對(duì)照,干擾FMNL2組細(xì)胞侵襲能力明顯下降00.001),而siFMNL2/siCOMMD10組能有效逆轉(zhuǎn)了干擾FMNL2的抑制作用(p0.05)。結(jié)果表明,COMMD10能夠抑制FMNL2的體外促細(xì)胞侵襲能力。(3)裸鼠皮下成瘤實(shí)驗(yàn)顯示：與NC組相比,siFMNL2組皮下腫瘤重量明顯減少(p0.05), siFMNL2/siCOMMD10組能有效減弱siFMNL2對(duì)皮下成瘤的抑制作用(p0.05)：以上結(jié)果表明COMMD10能夠抑制FMNL2的體內(nèi)促腫瘤生長(zhǎng)能力。(4)體內(nèi)肺轉(zhuǎn)移實(shí)驗(yàn)顯示,與NC組相比,siFMNL2組轉(zhuǎn)移至肺的腫瘤結(jié)節(jié)明顯減少(p0.05),siFMNL2/siCOMMD10組能有效逆轉(zhuǎn)siFMNL2對(duì)肺轉(zhuǎn)移的抑制作用(p0.05)；以上結(jié)果表明COMMD10能夠抑制FMNL2的體內(nèi)促肺轉(zhuǎn)移能力。結(jié)論1. FMNL2 (525-616a)結(jié)構(gòu)域與COMMD10 (1-132a)結(jié)構(gòu)域直接結(jié)合；2. COMMD10在結(jié)直腸癌組織中表達(dá)下調(diào),并抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞的侵襲及轉(zhuǎn)移能力；3.F-NL2通過(guò)COMMD10影響NF-κB信號(hào)通路活化,從而促進(jìn)結(jié)直腸癌侵襲和轉(zhuǎn)移。
【關(guān)鍵詞】：FMNL2 COMMD10 NF-κB 結(jié)直腸癌
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R735.34
【目錄】：

• 摘要3-13
• ABSTRACT13-28
• 前言28-33
• 第一章 FMNL2與COMMD10相互作用研究33-59
• 第一節(jié) FMNL2與COMMD10相互作用鑒定33-47
• 一、材料和方法33-43
• 二、統(tǒng)計(jì)43
• 三、結(jié)果43-47
• 第二節(jié) FMNL2調(diào)控COMMD10的表達(dá)47-59
• 一、材料和方法47-51
• 二、統(tǒng)計(jì)51
• 三、結(jié)果51-57
• 四.討論57-59
• 第二章 COMMD10抑制直直腸癌侵襲和轉(zhuǎn)移59-95
• 第一節(jié) COMMD10對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響59-85
• 一、材料和試劑59-65
• 二、統(tǒng)計(jì)65
• 三、結(jié)果65-85
• 第二節(jié) COMMD10在結(jié)直腸癌組織中的表達(dá)及其臨床意義85-95
• 一、材料和方法85-87
• 二、統(tǒng)計(jì)87
• 三、結(jié)果87-93
• 四.討論93-95
• 第三章 FMNL2通過(guò)COMMD10調(diào)控結(jié)直腸癌侵襲和轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制95-113
• 第一節(jié) COMMD10抑制NF-κB信號(hào)通路激活95-100
• 一、材料和方法95-97
• 二、統(tǒng)計(jì)97
• 三、結(jié)果97-100
• 第二節(jié) FMNL2通過(guò)COMMD10調(diào)控NF-κB信號(hào)通路100-102
• 一、材料和方法100-101
• 二、統(tǒng)計(jì)101
• 三、結(jié)果101-102
• 第三節(jié) FMNL2通過(guò)COMMD10調(diào)控結(jié)直腸癌細(xì)胞的生物學(xué)行為102-113
• 一、材料和方法102-103
• 二、統(tǒng)計(jì)103
• 三、結(jié)果103-110
• 四、討論110-113
• 參考文獻(xiàn)113-119
• 全文小結(jié)119-120
• 結(jié)論及意義120-121
• 英文縮寫注解121-122
• 攻讀碩士學(xué)位期間成果122-123
• 致謝123-125

【共引文獻(xiàn)】

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4 朱瑩;FGF/FGFR3與非經(jīng)典NF-κB信號(hào)通路的交互作用及其在多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞增殖中的意義[D];第三軍醫(yī)大學(xué);2013年

5 羅國(guó)軒;膠質(zhì)瘤中Pokémon對(duì)NF-κB/p65基因表達(dá)調(diào)控機(jī)理的研究[D];南華大學(xué);2013年

6 高迎秋;白氏文昌魚(yú)COMMD4基因克隆及免疫功能的分析[D];南京師范大學(xué);2013年

7 郭邦明;顱咽管瘤炎癥與細(xì)胞增殖性相關(guān)研究[D];南方醫(yī)科大學(xué);2013年

8 張靜;NF-κB“誘餌”寡核苷酸對(duì)TNBS誘導(dǎo)小鼠慢性腸纖維化的影響及療效觀察[D];南昌大學(xué)醫(yī)學(xué)院;2013年

9 鄭安紅;蝎毒多肽提取物聯(lián)合5-氟尿嘧啶對(duì)H22肝癌抑制作用的實(shí)驗(yàn)研究[D];濟(jì)南大學(xué);2013年

10 甘輝;三型腫瘤壞死因子alpha條件性表達(dá)載體的構(gòu)建及其表達(dá)[D];華中科技大學(xué);2013年

本文編號(hào)：946125