本文關(guān)鍵詞：外源性S100A6對(duì)人結(jié)直腸癌細(xì)胞中S100A6表達(dá)的正向調(diào)控及其機(jī)制研究

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【摘要】：研究背景與目的結(jié)直腸癌(colorectal carcinoma,CRC)是常見(jiàn)的一種惡性腫瘤,全球每年約有100萬(wàn)新增病例。當(dāng)前,CRC患者難以早期診斷;治療方法雖有明顯進(jìn)步,但是仍不能滿(mǎn)足臨床需要,尤其對(duì)中晚期的患者更是治療乏術(shù)。因此,進(jìn)一步研究CRC發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制、發(fā)展更有效的診治策略具有重要意義。S100A6(Calcyclin,鈣周期蛋白),是S100家族的成員之一,參與調(diào)控細(xì)胞的增殖分化及蛋白磷酸化等進(jìn)程。前期研究發(fā)現(xiàn),外源性重組人S100A6蛋白可增加腫瘤細(xì)胞內(nèi)的S100A6蛋白水平,提示腫瘤微環(huán)境中的S100A6可能參與調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞內(nèi)的S100A6表達(dá)。也有研究報(bào)道,S100A6高表達(dá)與β-catenin的升高常常同時(shí)存在于腫瘤中,且S100A6是Wnt/β-catenin信號(hào)通路的靶基因;我們近期研究發(fā)現(xiàn),S100A6可以增加多種腫瘤細(xì)胞中的β-catenin水平,這些結(jié)果初步提示微環(huán)境中的S100A6可能通過(guò)激活Wnt/β-catenin信號(hào)通路正向調(diào)控腫瘤細(xì)胞S100A6的表達(dá)。因此,本研究將以人結(jié)直腸癌細(xì)胞HCT116及SW480為研究對(duì)象,探討微環(huán)境中的S100A6是否正向調(diào)控CRC細(xì)胞中S100A6基因的表達(dá)、其機(jī)制是否涉及wnt/β-catenin信號(hào)通路的激活,以期為crc的發(fā)生發(fā)展機(jī)制及s100a6在crc發(fā)生發(fā)展中的作用的研究積累實(shí)驗(yàn)依據(jù),也為crc的診治提供新思路。方法1.重組人s100a6蛋白(recombinanthumans100a6,rhs100a6)的制備與驗(yàn)證:將重組質(zhì)粒pgst-hrv3c-hs100a6及pgst-hrv3c分別化轉(zhuǎn)至感受態(tài)細(xì)菌e.colibl21中,在lb培養(yǎng)基中培養(yǎng)擴(kuò)菌,異丙基-β-d-硫代半乳糖苷(isopropylthio-β-d-galactoside,iptg)分別誘導(dǎo)表達(dá)融合蛋白谷胱甘肽s轉(zhuǎn)移酶-人鼻病毒3c蛋白酶酶切序列-hs100a6(glutathionestransferase-humanrhinovirus3cproteasecleavagesite-hs100a6,gst-clvhrv3c-hs100a6)及重組蛋白谷胱甘肽s轉(zhuǎn)移酶-人鼻病毒3c蛋白酶(glutathionestransferase-humanrhinovirus3cprotease,gst-hrv3c)。冰上超聲破菌后,谷胱甘肽-瓊脂糖4b球珠(glutathionesepharose4bbeads,gs4bb)分別分離純化上述兩種融合蛋白,隨后gst-hrv3c酶切g(shù)st-clvhrv3c-hs100a6(4℃),再經(jīng)gs4b球珠純化,以去除其中的gst-hrv3c酶和切下的gst,即可獲得重組rhs100a6蛋白。經(jīng)十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(sodiumdodecylsulfate-polyacrylamidegelelectrophoresis,sds-page)、考馬斯亮藍(lán)染色和westernblot鑒定,分光光度儀測(cè)定所得重組蛋白的濃度,再分裝并于-80℃保存?zhèn)溆谩?.融合蛋白gst-hs100a6蛋白(gst-hs100a6)的制備與鑒定:將重組質(zhì)粒pgst-moluc-hs100a6及pgst-moluc分別化轉(zhuǎn)至感受態(tài)細(xì)菌e.colibl21中,在lb培養(yǎng)基中培養(yǎng)擴(kuò)菌,iptg分別誘導(dǎo)表達(dá)融合蛋白gst-hs100a6及gst。冰上超聲破菌后,gs4b球珠分別分離純化,得到上述兩種蛋白。經(jīng)sds-page、考馬斯亮藍(lán)染色和westernblot鑒定,分光光度儀對(duì)所得重組蛋白進(jìn)行定量,分裝并于-80℃保存?zhèn)溆谩?.重組腺病毒的擴(kuò)增及驗(yàn)證:通過(guò)hek293細(xì)胞擴(kuò)增攜帶人β-catenin基因的重組腺病毒(adβ-cat)及其對(duì)照腺病毒(adgfp)、攜帶人β-catenin的sirna基因的重組腺病毒(adsiβ-cat)及其對(duì)照腺病毒(adrfp),并將擴(kuò)增所得重組腺病毒分別感染人crc細(xì)胞系hct116和sw480,經(jīng)rt-pcr及westernblot驗(yàn)證這些重組腺病毒感染crc細(xì)胞的有效性。4.rhs100a6對(duì)人crc細(xì)胞系hct116、sw480中s100a6表達(dá)的影響及相關(guān)機(jī)制的探討:4-1rhs100a6對(duì)人crc細(xì)胞系hct116、sw480中s100a6基因表達(dá)的影響:rhs100a6蛋白(10μg/ml)分別處理hct116、sw480及正常腸上皮細(xì)胞fhc后,采用rt-pcr檢測(cè)細(xì)胞s100a6mrna的水平;rhs100a6(10μg/ml)及gst-hs100a6(100μg/ml)分別處理hct116、sw480,并以gst為對(duì)照,通過(guò)westernblot檢測(cè)這些細(xì)胞中s100a6的蛋白水平。4-2rhs100a6對(duì)人crc細(xì)胞系hct116、sw480中β-catenin的影響:rhs100a6(10μg/ml)分別處理hct116、sw480后,采用rt-pcr檢測(cè)細(xì)胞β-cateninmrna水平,用westernblot分別檢測(cè)胞漿、胞核及全細(xì)胞中的β-catenin水平,用免疫細(xì)胞化學(xué)(immunocytochemistry,icc)及細(xì)胞免疫熒光法檢測(cè)細(xì)胞中β-catenin的表達(dá)與分布變化。4-3wnt/β-catenin通路活性的變化對(duì)rhs100a6上調(diào)人crc細(xì)胞系hct116、sw480中s100a6基因轉(zhuǎn)錄作用的影響:(1)驗(yàn)證wnt/β-catenin通路可調(diào)控s100a6的表達(dá):將adβ-cat及adgfp、adsiβ-cat及adrfp分別感染hct116、sw480,采用rt-pcr及westernblot檢測(cè)細(xì)胞中s100a6的表達(dá)水平;(2)下調(diào)wnt/β-catenin通路活性對(duì)rhs100a6上調(diào)人crc細(xì)胞系hct116、sw480中s100a6基因轉(zhuǎn)錄的影響:設(shè)置blank組、adrfp組、adsiβ-cat組、rhs100a6組、adsiβ-cat+rhs100a6共5個(gè)實(shí)驗(yàn)組,采用rt-pcr及qrt-pcr檢測(cè)各組細(xì)胞中s100a6mrna的水平。4-4干擾wnt/β-catenin通路活性后對(duì)s100a6促crc細(xì)胞增殖遷移的影響:實(shí)驗(yàn)分組同方法4-3(2),通過(guò)adsiβ-cat阻斷crc細(xì)胞中wnt/β-catenin通路,采用mtt、劃痕愈合試驗(yàn)和transwell(無(wú)基質(zhì)膠)試驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞的增殖和遷移能力。5.rhs100a6影響β-catenin入核的相關(guān)機(jī)制:rhs100a6分別處理hct116、sw480后,采用westernblot分別檢測(cè)細(xì)胞中p-akt(ser473)、p-akt(ser308)、t-akt、p-gsk3β、t-gsk3β的蛋白水平。結(jié)果1.制備的重組蛋白rhs100a6和gst-hs100a6經(jīng)sds-page顯示其相對(duì)分子質(zhì)量分別約為10kd和36kd,符合預(yù)期。同時(shí),westernblot證實(shí)這兩種重組蛋白均能被s100a6單克隆抗體特異識(shí)別。2.擴(kuò)增的adβ-cat、adsiβ-cat分別感染hct116、sw480細(xì)胞后,rt-pcr及westernblot檢測(cè)結(jié)果一致提示β-catenin水平分別出現(xiàn)相應(yīng)的上調(diào)和下調(diào)。3.外源性s100a6通過(guò)激活人crc細(xì)胞中wnt/β-catenin信號(hào)通路正向調(diào)控s100a6基因的表達(dá):3-1rhs100a6分別處理hct116、sw480和fhc細(xì)胞后,前兩種細(xì)胞中的s100a6mrna水平均上調(diào)(p0.01),而fhc細(xì)胞中的s100a6mrna無(wú)明顯變化(p0.05)。rhs100a6與gst-hs100a6蛋白分別處理hct116、sw480后,細(xì)胞中的s100a6蛋白水平均上調(diào)。提示外源性s100a6可正向調(diào)控crc細(xì)胞中s100a6的表達(dá)。3-2rhs100a6處理hct116、sw480后,兩種細(xì)胞中的β-cateninmrna水平無(wú)明顯變化,但胞核中β-catenin與細(xì)胞中總的β-catenin蛋白水平上調(diào)(p0.05),icc和細(xì)胞免疫熒光結(jié)果也一致證實(shí)crc細(xì)胞中β-catenin增加并向胞核聚集。提示外源性s100a6可激活crc細(xì)胞中wnt/β-catenin信號(hào)通路。3-3adβ-cat和adsiβ-cat分別感染hct116、sw480后,兩種細(xì)胞中的s100a6的mrna和蛋白均出現(xiàn)相應(yīng)的上調(diào)或下調(diào)。證實(shí)wnt/β-catenin信號(hào)通路參與調(diào)控crc細(xì)胞中s100a6基因的表達(dá),即s100a6是該信號(hào)通路的靶基因。3-4adsiβ-cat與rhs100a6聯(lián)合處理組的s100a6mrna水平明顯低于單獨(dú)rhs100a6處理組(p0.01)。提示干擾β-catenin后能部分逆轉(zhuǎn)rhs100a6的促hct116和sw480細(xì)胞中s100a6基因轉(zhuǎn)錄的作用。進(jìn)一步證明微環(huán)境中的s100a6對(duì)crc細(xì)胞中s100a6基因表達(dá)的正向調(diào)控機(jī)制涉及Wnt/β-catenin信號(hào)通路的激活。3-5 Adsiβ-cat與rhS100A6聯(lián)合處理組細(xì)胞的增殖及遷移能力均低于rhS100A6單獨(dú)處理組(P0.01),表明下調(diào)Wnt/β-catenin信號(hào)通路后S100A6的促CRC細(xì)胞增殖遷移能力明顯減弱。該結(jié)果除支持S100A6促CRC增殖遷移的作用及其機(jī)制涉及Wnt/β-catenin信號(hào)通路的激活外,同時(shí)也支持我們的假設(shè),即該通路參與介導(dǎo)微環(huán)境中S100A6對(duì)CRC細(xì)胞中S100A6的正向調(diào)控,因此下調(diào)該通路,便可部分阻斷外源性S100A6對(duì)CRC細(xì)胞中S100A6基因自身表達(dá)的正向調(diào)控,進(jìn)而部分阻斷外源性S100A6促CRC細(xì)胞增殖遷移的作用。4.rhS100A6處理HCT116、SW480后,細(xì)胞中p-AKT(Ser473)、p-GSK3β水平均上調(diào)(P0.01)。提示外源性S100A6可能通過(guò)激活A(yù)KT信號(hào)通路而促進(jìn)β-catenin入核。結(jié)論1.微環(huán)境中的S100A6對(duì)CRC細(xì)胞中S100A6的表達(dá)具有正向調(diào)控作用,其機(jī)制涉及Wnt/β-catenin信號(hào)通路的激活。2.微環(huán)境中的S100A6可能通過(guò)激活A(yù)KT信號(hào)通路促進(jìn)CRC細(xì)胞漿中的β-catenin入核。
【關(guān)鍵詞】：S100A6 結(jié)直腸癌 Wnt/β-catenin信號(hào)通路 正向調(diào)控
【學(xué)位授予單位】：重慶醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類(lèi)號(hào)】：R735.34
【目錄】：

• 英漢縮略語(yǔ)名詞對(duì)照4-6
• 中文摘要6-12
• 英文摘要12-19
• 前言19-23
• 參考文獻(xiàn)20-23
• 第一部分 重組蛋白rhS100A6、GST-h S100A6和重組腺病毒的制備及鑒定23-36
• 1 材料與方法23-32
• 2 結(jié)果32-34
• 3 討論34
• 參考文獻(xiàn)34-36
• 第二部分rhS100A6對(duì)人結(jié)直腸癌細(xì)胞中S100A6表達(dá)的影響及機(jī)制探討36-55
• 1 材料與方法36-42
• 2 結(jié)果42-51
• 3 討論51-53
• 參考文獻(xiàn)53-55
• 全文總結(jié)55-56
• 文獻(xiàn)綜述56-65
• 參考文獻(xiàn)60-65
• 致謝65-66
• 碩士期間發(fā)表的論文66

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6 張繼民,劉明姬,n澗托，

本文編號(hào)：944630