本文關(guān)鍵詞：骨化三醇增強HpD光動力治療乳腺癌療效的實驗研究

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【摘要】：研究背景惡性腫瘤的發(fā)病率逐年上升,嚴重威脅人類的健康和生活。乳腺癌現(xiàn)在是女性最常見的惡性腫瘤之一,發(fā)病率正逐年上升。在歐美國家,乳腺癌的比例達到女性惡性腫瘤的25%～30%。20世紀末,統(tǒng)計資料表明全世界大約有130萬人診斷為乳腺癌,而且有40萬人死于該病。腫瘤治療的方法包括手術(shù)治療、放射治療、化學(xué)治療、靶向治療、生物治療以及各種微創(chuàng)治療手段等。微創(chuàng)治療包括光動力治療、冷凍、射頻、介入治療、微波等等。隨著社會的發(fā)展,人們不僅會關(guān)注疾病本身,而且也會更加關(guān)心外觀、功能和心理狀態(tài)。光動力治療作為一種有著巨大潛能的治療手段,以其安全、有效、副作用小、可重復(fù)性好、保護容貌和器官功能、相對成本低和可協(xié)同性等優(yōu)點在腫瘤的治療中的作用脫穎而出。對于癌前病變和早期腫瘤,光動力治療可以達到治愈效果。而對于晚期腫瘤,光動力治療也可以作為一種姑息治療的手段減輕患者的癥狀,提高其生活質(zhì)量。光動力治療不但可以應(yīng)用于皮膚淺表部位的腫瘤,也可以用于呼吸道、胃腸道、膀胱等部位的腫瘤,同時,也可以在一些非腫瘤的疾病中發(fā)揮重要作用,如年齡相關(guān)性黃斑變性、尖銳濕疣、抗細菌和病毒等等。光動力治療的最大優(yōu)勢是保護容貌和重要器官功能。血卟啉衍生物是第一代光敏劑,經(jīng)過多年的實驗和臨床研究證明是有效的,現(xiàn)已廣泛用于臨床。光動力治療利用光敏劑在一定的時間后選擇性積聚在腫瘤組織中的特性,可以選擇性地殺傷腫瘤細胞。應(yīng)用特定波長的激光照射局部腫瘤組織,可以激活光敏劑,使光敏劑與腫瘤細胞內(nèi)的氧分子發(fā)生光化學(xué)作用,產(chǎn)生一系列化學(xué)性質(zhì)活潑的單態(tài)氧(1O2)和其他一些活性氧物質(zhì)(Radical oxygen species, ROS),它們可以氧化損傷細胞內(nèi)的蛋白質(zhì)、核酸等大分子物質(zhì),發(fā)生以下反應(yīng)：1.直接殺傷細胞；2.破壞腫瘤組織中的微血管,造成局部缺血缺氧環(huán)境,導(dǎo)致腫瘤細胞的死亡；3.局部氧化應(yīng)激反應(yīng)可以激活補體系統(tǒng),能促使多種炎癥及免疫因子產(chǎn)生及釋放,誘導(dǎo)各種炎癥細胞、免疫細胞快速浸潤至腫瘤局部組織,最后形成全身性的抗腫瘤反應(yīng)。光動力治療三要素：1.光敏劑-系統(tǒng)或局部應(yīng)用；2.激光-與光敏劑最大吸收波長相適應(yīng)的近紅外激光；3.氧-能夠在激發(fā)后變成單態(tài)氧(’O2)的分子氧。光動力治療雖然有很多優(yōu)點,但是也有其本身的不足,導(dǎo)致其應(yīng)用受限。例如,現(xiàn)有光動力技術(shù)的透射深度有限,腫瘤消退后復(fù)發(fā)率較高,對遠處轉(zhuǎn)移病灶治療效果有限等。其作用受限的其中一個原因就是光敏劑在腫瘤細胞內(nèi)的聚集有限,導(dǎo)致產(chǎn)生的活性氧物質(zhì)不足以殺滅腫瘤細胞。腫瘤在進行光動力治療后容易復(fù)發(fā),患者的生命健康再次受到威脅。有研究表明骨化三醇可以通過提高糞卟啉原合成酶的表達,從而增加ALA在膠質(zhì)瘤細胞內(nèi)卟啉原的含量,從而增強光動力治療腫瘤的療效。為了研究骨化三醇對乳腺癌細胞是否有類似的作用,我們設(shè)計了此課題來研究增強光動力治療乳腺癌療效的方法。研究目的1.探討骨化三醇體外對人乳腺癌細胞MCF7和MDA-MB-231生長的影響,以確定骨化三醇對乳腺癌細胞的合適的無毒濃度。并選擇合適的血卟啉注射液濃度作為光動力治療的終濃度。2.應(yīng)用激光光照細胞,處理后檢測各組細胞的吸光度(OD)值,計算各組細胞的抑制率,確定何種處理方法對細胞的殺傷作用最強。3.檢測各組細胞處理后的凋亡率,ROS產(chǎn)生的量,確定何種處理方法對細胞的凋亡及活性氧的產(chǎn)生影響最大。4.檢測各組細胞的熒光強弱,推測細胞內(nèi)卟啉原含量的高低。應(yīng)用RT-PCR檢測細胞內(nèi)卟啉原合成酶的表達,證實癌細胞內(nèi)卟啉原含量增加與卟啉原合成酶的表達升高有關(guān)。研究方法和內(nèi)容1.通過MTT法檢測各組細胞活性,利用多功能酶標(biāo)儀檢測細胞OD值,研究不同濃度的骨化三醇對MCF7和MDA-MB-231細胞的影響,確定并選擇合適的對細胞生長無影響的骨化三醇濃度。2.將細胞分為五組,分別為實驗組(PDT+骨化三醇)、光敏劑組(PDT)、骨化三醇組(光照+骨化三醇)、光照組(僅光照)和空白對照組,分別予以不同的處理。處理結(jié)束后24h顯微鏡下觀察細胞,用MTT法測各組細胞的OD值,計算細胞活性。實驗重復(fù)三次。3.細胞處理如上,處理結(jié)束后8h應(yīng)用FITC/PI雙染法流式細胞術(shù)檢測各組細胞的凋亡率,統(tǒng)計早期凋亡率和晚期凋亡率之和。細胞處理結(jié)束后,加入活性氧物質(zhì)(ROS)檢測試劑,30分鐘后檢測各組細胞活性氧物質(zhì)強度值,并在熒光顯微鏡下觀察各組細胞熒光。4.細胞接種完成后,分別加入骨化三醇和(或)血卟啉注射液,24h后去除培養(yǎng)液,用PBS液清洗3遍,再加入PBS液,利用多功能酶標(biāo)儀檢測各組細胞光敏劑產(chǎn)生的熒光。5.將乳腺癌細胞分別分為兩組,分別為實驗組(骨化三醇預(yù)處理)和對照組(不處理)。經(jīng)骨化三醇處理后48小時,收集各組細胞的RNA,經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄后進行RT-PCR實驗,檢測卟啉原合成酶系中是否有表達增加的酶。卟啉合成酶系：(PBGD(卟啉原脫氨酶),UROS(尿卟啉原合成酶),CPOX(糞卟啉原氧化酶)和FECH(鐵螯合酶),各個酶類的mRNA基因序列如下表。研究結(jié)果1.選擇骨化三醇對乳腺癌細胞的無毒濃度根據(jù)骨化三醇說明書及相關(guān)文獻報道,設(shè)置濃度梯度。骨化三醇濃度為10-8M、10-10M時,對MCF7細胞的抑制率分別為23.53%±4.96%、9.77±1.78%,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.01),濃度為10-12M、10-14M、10-16M時,抑制率分別為0.70%±0.17%、0.67%±0.07%、0.35%±0.16%,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。骨化三醇濃度為10-8M、10-10M時,對MDA-MB-231細胞的抑制率分別為24.33%±5.13%、14.80%±5.24%,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.01),濃度為10-12M、10-14M、10-16M時,抑制率分別為1.36%±0.34%、1.52%±0.35%、1.10%±0.14%,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。由實驗結(jié)果可以看出,當(dāng)骨化三醇濃度低于或等于10-12M時,其對細胞生長和活性無影響。為了排除骨化三醇本身對實驗的影響,所以選取10-12M作為本研究中細胞的實驗濃度。2.光動力治療后各組細胞的抑制率比較經(jīng)過光照后,MCF7乳腺癌細胞實驗組、光敏劑組、骨化三醇組,空白光照組抑制率分別為89.03%±0.79%、77.76%±2.27%、20.54%±2.32%、18.06%±3.60%,實驗組抑制率最高,與其他組比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.01)。MDA-MB-231乳腺癌細胞光照后實驗組、光敏劑組、骨化三醇組,空白光照組抑制率分別為75.82%±1.43%、46.38%±0.64%、16.98%±0.28%、13.49%±2.04%。實驗組抑制率最高,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。3.細胞光照后檢測ROS值細胞經(jīng)過照光后30min開始收集細胞檢測ROS。MCF7乳腺癌細胞實驗組、光敏劑組、骨化三醇組、空白光照組、空白組ROS檢測值量化后分別為3.903±0.098、2.713±0.218、2.239±0.945、1.835±0.127、0.561±0.004。實驗組ROS檢測值最高,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.01)。MDA-MB-231乳腺癌細胞實驗組、光敏劑組、骨化三醇組、空白光照組、空白組量化后分別為3.628±0.045、2.269±0.175、1.649±0.296、1.472±0.098、0.573±0.096。實驗組ROS檢測值最高,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.01)。4.細胞光照后細胞凋亡率檢測細胞光照后8h收集細胞進行凋亡檢測。統(tǒng)計早期凋亡和晚期凋亡比例之和。MCF7乳腺癌細胞實驗組、光敏劑組、骨化三醇組、空白光照組、空白組凋亡率分別為0.4407±0.01255、0.19±0.0094、0.1023±0.0023、0.0680±0.02703、0.0047±0.0009。實驗組凋亡率最高,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.01)。MDA-MB-231乳腺癌細胞實驗組、光敏劑組、骨化三醇組、空白光照組、空白組分別為0.3110±0.0087、0.1980±0.0040、0.0903±0.0030、0.0623±0.02630、0.0073±0.0009。實驗組凋亡率最高,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.01)。5.細胞熒光強度檢測MCF7乳腺癌細胞實驗組、光敏劑組、骨化三醇組、空白光照組、空白組熒光強度檢測值分別為386.056±13.540、285.871±13.292、2.702±0.199、2.750±0.239、2.904±0.142。實驗組熒光強度檢測值最高,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.01)。MDA-MB-231乳腺癌細胞實驗組、光敏劑組、骨化三醇組、空白光照組、空白組熒光強度檢測值分別為313.254±6.084、250.048±3.156、2.798±0.181、2.683±1.400。實驗組熒光強度檢測值最高,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.01)。6. RT-PCR實驗RT-PCR實驗表明,兩株乳腺癌細胞的卟啉生物合成酶系PBGD(卟啉原脫氨酶),UROS(尿卟啉原合成酶),CPOX(糞卟啉原氧化酶)和FECH(鐵螯合酶)中,只有CPOX表達增加(P0.05)。研究結(jié)論1.經(jīng)過骨化三醇預(yù)處理的乳腺癌細胞,當(dāng)濃度≥10-10M時,處理組細胞的抑制率高于空白對照組(P0.05)。而骨化三醇濃度≤10-12M時,處理組細胞抑制率與空白對照組無差異(P0.05)。為了排除骨化三醇本身對乳腺癌細胞生長的影響,選擇骨化三醇濃度為：10-12M。2.各組乳腺癌細胞經(jīng)光動力治療后,實驗組抑制率最高。骨化三醇組與空白光照組經(jīng)過處理后,對乳腺癌細胞的抑制率無差異(P0.05)。說明合適濃度的骨化三醇本身在沒有光敏劑的作用下,對光照作用的強弱無影響。3.各組乳腺癌細胞經(jīng)光動力治療后,實驗組ROS檢測值最高。骨化三醇組與空白光照組經(jīng)過處理后,ROS檢測值無差異(P0.05)。說明合適濃度的骨化三醇預(yù)處理后對乳腺癌細胞光照后活性氧的產(chǎn)生無影響。4.各組乳腺癌細胞經(jīng)光動力治療后,實驗組凋亡率最高。骨化三醇組與空白光照組經(jīng)過處理后,兩組細胞的凋亡率無差異(P0.05)。5.各組乳腺癌細胞熒光檢測值實驗組最高。乳腺癌細胞經(jīng)過骨化三醇預(yù)處理后,細胞內(nèi)光敏劑含量增加。此實驗檢測的熒光由光敏劑發(fā)出,骨化三醇組與光照組無光敏劑處理,兩組熒光強度值對比無差異。6. RT-PCR實驗表明,CPOX(糞卟啉原氧化酶)表達增加。CPOX(糞卟啉原氧化酶)為卟啉原合成酶系的酶類,說明乳腺癌細胞內(nèi)光敏劑含量增加與細胞本身CPOX(糞卟啉原氧化酶)表達增加有關(guān)�？傊�,骨化三醇可以增強HpD-PDT治療乳腺癌的效果。在光照后,實驗組的ROS產(chǎn)生更多,細胞凋亡率更高。骨化三醇在沒有光敏劑存在的情況下,本身并不能增加光動力治療的效果。機制研究表明,實驗組經(jīng)過骨化三醇和光敏劑預(yù)處理后熒光強度更高,細胞內(nèi)原卟啉含量更高。經(jīng)過骨化三醇處理的細胞CPOX表達增加,CPOX為原卟啉合成的關(guān)鍵酶,說明細胞內(nèi)原卟啉含量增加與細胞CPOX表達增加有關(guān)。
【關(guān)鍵詞】：光動力療法 血卟啉衍生物 骨化三醇 乳腺癌 MCF-7 MDA-MB-231
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R737.9
【目錄】：

• 摘要3-10
• ABSTRACT10-19
• 第一章 前言19-30
• 1.1 光動力治療的基本原理、作用機制和優(yōu)缺點25-28
• 1.2 骨化三醇相關(guān)的相關(guān)特點及作用28-30
• 第二章 骨化三醇聯(lián)合光動力治療增強乳腺癌治療療效的初步探討30-54
• 2.1 材料與儀器30-32
• 2.2 實驗方法32-39
• 2.3 實驗結(jié)果39-49
• 2.4 討論49-52
• 2.5 結(jié)論52-54
• 全文小結(jié)54-55
• 參考文獻55-61
• 中英文對照縮略詞表61-62
• 攻讀學(xué)位期間成果62-63
• 致謝63-65

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