本文關(guān)鍵詞：乙醇對HepG2細胞形態(tài)、VASN表達及分泌的影響

  更多相關(guān)文章： 乙醇 VASN 細胞遷移 細胞膜泡

【摘要】：原發(fā)性肝癌是一種常見的惡性腫瘤,其發(fā)病率居于腫瘤發(fā)病率的第六位,而病死率僅次于肺癌,我國肝癌患者占全球肝癌患者總數(shù)的一半以上,死亡率也居高不下。已確定誘發(fā)肝癌的因素包括乙肝或丙肝病毒感染、黃曲霉毒素、酒精等,新增的風險因素包括糖尿病、肥胖,非酒精性脂肪肝等。肝臟是乙醇代謝的主要器官,長期過量飲酒嚴重損傷肝臟,導致脂肪肝、肝硬化,明顯增加肝癌的罹患率。第一部分:乙醇促進HepG2細胞表達、分泌VASN蛋白及對HUVEC細胞遷移的影響。VASN蛋白是一種典型的Ⅰ型跨膜蛋白,包含串聯(lián)的亮氨酸結(jié)構(gòu)域,類表皮生長因子結(jié)構(gòu)域和纖聯(lián)蛋白Ⅲ結(jié)構(gòu)域,其可以被金屬蛋白酶ADAM17剪切,從細胞膜上脫落分泌至細胞外,產(chǎn)生可溶性VASN蛋白(sVASN)。人VASN蛋白主要表達于主動脈的血管平滑肌細胞、腎臟、胎盤組織等,其它組織中表達水平低。有報道顯示,乳腺癌細胞高表達VASN蛋白,其分泌的sVASN蛋白能夠抑制TGFβ信號通路的激活,發(fā)揮促腫瘤的作用。VASN在人腦腫瘤組織、細胞中高表達,當siRNA敲低膠質(zhì)細胞瘤中VASN表達水平,低氧或TNF-α誘導的細胞凋亡率明顯升高,提示VASN可能具有抗低氧誘導凋亡、促進腫瘤進展的作用。我們實驗室前期工作中,利用SELEX技術(shù)從肝癌患者血清中篩選出潛在的肝癌生物標志物VASN蛋白,并且證實VASN蛋白在肝癌細胞、肝癌組織中高表達。進一步實驗表明,HepG2來源的外泌體形式VASN能夠促進HUVEC細胞遷移。長期慢性乙醇刺激導致HepG2細胞多種基因表達水平的改變,影響急性應激反應、氨基酸代謝,碳代謝以及脂質(zhì)代謝等途徑。本部分將利用乙醇刺激HepG2細胞,檢測VASN蛋白的表達變化及其可能對HUVEC細胞的影響。為模擬日常生活中的中度、重度飲酒以及酗酒,我們選取與之相對應的25、50、100mM三種乙醇濃度對HepG2細胞進行刺激。乙醇刺激不同時間(24、48、72h)后,我們提取細胞總RNA,qPCR檢測發(fā)現(xiàn)三種濃度乙醇刺激均可導致VASN蛋白的mRNA水平顯著上升;細胞總蛋白Western Blot結(jié)果顯示,三種濃度乙醇均促進VASN蛋白表達。收集乙醇刺激后的上清進行濃縮,檢測其中VASN蛋白水平,Western Blot結(jié)果顯示,上清中VASN蛋白水平在乙醇刺激后顯著上升。以上結(jié)果表明乙醇刺激可以促進HepG2細胞VASN蛋白的表達與分泌。VASN蛋白不僅可以被金屬蛋白酶ADAM17剪切,胞外結(jié)構(gòu)域脫落成為sVASN;而我們前期工作發(fā)現(xiàn),VASN蛋白還存在于肝癌細胞分泌的外泌體中。乙醇刺激可以促進HepG2細胞培養(yǎng)上清中VASN蛋白水平升高,究竟是何種形式的VASN分泌增加,我們進行了探討。我們利用外泌體提取試劑從乙醇刺激的細胞培養(yǎng)上清中純化外泌體,同時收集去除外泌體的細胞上清。通過對外泌體進行蛋白定量分析,結(jié)果顯示乙醇刺激后外泌體的總蛋白量顯著升高;同時westernblot檢測外泌體標志分子hsp70蛋白水平,發(fā)現(xiàn)乙醇刺激后hsp70蛋白明顯上升,其結(jié)果與蛋白定量相一致,表明乙醇可以促進hepg2細胞分泌外泌體。檢測外泌體中vasn蛋白,westernblot結(jié)果顯示乙醇處理組的外泌體中vasn蛋白水平升高。同時我們也檢測了去除外泌體的細胞上清中svasn水平,結(jié)果表明,乙醇刺激也可以促進hepg2分泌svasn。我們進一步研究乙醇促進hepg2細胞表達分泌vasn蛋白,對于huvec細胞會產(chǎn)生怎樣影響。我們使用上述濃度乙醇刺激huvec細胞,結(jié)果發(fā)現(xiàn)huvec細胞的遷移明顯受到抑制。隨后,我們將hepg2細胞與huvec細胞共培養(yǎng),結(jié)果發(fā)現(xiàn),在乙醇刺激條件下,相對于單獨培養(yǎng)的huvec細胞,與正常hepg2細胞共培養(yǎng)的huvec細胞遷移速率明顯加快,細胞穿膜數(shù)量增加,而與敲低vasn的hepg2細胞共培養(yǎng)的huvec細胞遷移速率則無明顯變化,細胞穿膜數(shù)量顯著減少,說明乙醇刺激hepg2細胞分泌vasn,而vasn在促進huvec細胞遷移,趨化過程中發(fā)揮重要作用。上述結(jié)果提示,乙醇促進hepg2細胞表達、分泌vasn蛋白,調(diào)節(jié)vasn蛋白介導的hepg2與huvec細胞間的“通訊”。本研究有助于闡明乙醇在肝癌發(fā)生發(fā)展中的作用;同時,vasn作為肝癌組織微環(huán)境中的重要組分,也可能成為肝癌防治藥物的候選靶分子。第二部分:致死量乙醇短時間刺激hepg2細胞膜泡產(chǎn)生的初步觀察乙醇通過多種機制影響細胞的生命活動,不同濃度乙醇作用有所不同。100mm乙醇可以促進肝癌細胞的遷移、腫瘤血管生成以及外泌體的分泌,而1.5m乙醇可以顯著增加胰腺導管腺癌細胞的細胞膜通透性,直接將無水乙醇注入肝癌腫瘤中央,可以使腫瘤細胞及附近血管內(nèi)皮細胞迅速脫水,引發(fā)細胞內(nèi)蛋白質(zhì)凝固變性,從而導致腫瘤細胞壞死。細胞皮層(cellcortex)是一層富含肌動蛋白的結(jié)構(gòu),緊貼細胞質(zhì)膜的細胞質(zhì)區(qū)域,牽引臨近的肌動蛋白微絲,形成外膜張力。當皮層與質(zhì)膜的結(jié)合處破壞或皮層溶解,細胞質(zhì)就會流向這些位點,流體壓力導致質(zhì)膜膨出,形成“膜泡”(bleb)。細胞膜泡通常在細胞膜上可以發(fā)展到2μm,然后可以收縮至膜泡起始部位。膜泡見于許多細胞活動過程,在細胞的三維運動中至關(guān)重要,如細胞運動、腫瘤細胞侵襲、凋亡、應激反應過程中。我們發(fā)現(xiàn)2m乙醇刺激hepg2細胞膜泡形成。我們對細胞膜泡進行了形態(tài)學觀察,一部分細胞膜泡會隨著乙醇處理時間的延長而在細胞膜表面發(fā)生融合、收縮,一部分細胞膜泡會從細胞表面脫落,懸浮在培養(yǎng)基中。我們對乙醇誘導細胞膜泡產(chǎn)生的濃度進行摸索,結(jié)果顯示100mm、400mm乙醇長期間刺激都不能誘導膜泡的生成,而在2m乙醇刺激10min時,我們就可以觀察到大量細胞膜泡的產(chǎn)生。我們利用臺盼藍對2m乙醇刺激的膜泡細胞進行染色,發(fā)現(xiàn)細胞膜通透性增強;通過掃描電鏡觀察膜泡細胞,結(jié)果發(fā)現(xiàn)乙醇刺激使細胞表面變得粗糙,微絨毛消失,膜泡突出,膜泡細胞與基質(zhì)連接減弱,部分細胞表面出現(xiàn)孔洞。利用染料Dil與鬼筆環(huán)肽分別對細胞膜與肌動蛋白進行染色,熒光顯微鏡觀察,結(jié)果發(fā)現(xiàn)乙醇刺激后細胞膜泡從細胞膜上突出,變圓,膜泡內(nèi)含有細胞質(zhì)成分,但是不含有細胞骨架中的肌動蛋白,說明細胞膜脫離細胞骨架,致使細胞形態(tài)發(fā)生變化。最后,我們檢測了細胞膜泡率與細胞死亡率。實驗結(jié)果表明,細胞膜泡率與死亡率隨乙醇刺激時間的延長而增加,結(jié)合對細胞形態(tài)學的分析,可以發(fā)現(xiàn),大部分膜泡細胞的最終命運是死亡,但仍有極少數(shù)細胞存活,并且能夠繼續(xù)增殖。此外,我們收集了細胞外囊泡進行檢測,結(jié)果表明,2M乙醇明顯促進細胞外囊泡的分泌,這些囊泡具有怎樣的生物學功能尚不明確。本部分初步探討了致死量乙醇對HepG2細胞的影響,我們發(fā)現(xiàn)2M乙醇誘導細胞外囊泡的分泌、膜泡形成、大量細胞死亡,但仍有少量膜泡細胞存活。今后我們將繼續(xù)研究產(chǎn)生乙醇“耐受”的膜泡細胞生物學特性與功能,膜泡與細胞外囊泡的組成及其生物學功能。
【關(guān)鍵詞】：乙醇 VASN 細胞遷移 細胞膜泡
【學位授予單位】：中國人民解放軍軍事醫(yī)學科學院
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R735.7
【目錄】：

• 縮略詞表4-6
• 摘要6-9
• Abstract9-12
• 第一部分 乙醇促進HepG2細胞表達、分泌VASN蛋白及對HUVEC細胞遷移的影響12-30
• 前言12-13
• 1.1 實驗材料13-17
• 1.2 實驗方法17-20
• 1.3 實驗結(jié)果20-28
• 1.4 討論28-29
• 1.5 結(jié)論29-30
• 第二部分 致死量乙醇短時間刺激HepG2細胞膜泡產(chǎn)生的初步觀察30-43
• 前言30-31
• 2.1 實驗材料31-32
• 2.2 實驗方法32-34
• 2.3 實驗結(jié)果34-41
• 2.4 討論41-42
• 2.5 結(jié)論42-43
• 參考文獻43-46
• 綜述46-51
• 參考文獻49-51
• 致謝51-52
• 附錄Ⅰ：個人簡歷52-53

【相似文獻】

中國碩士學位論文全文數(shù)據(jù)庫 前1條

1 孫樂橋;乙醇對HepG2細胞形態(tài)、VASN表達及分泌的影響[D];中國人民解放軍軍事醫(yī)學科學院;2016年

，

本文編號：935743