發(fā)布時(shí)間：2017-09-28 12:07

  本文關(guān)鍵詞：乙醇對(duì)HepG2細(xì)胞形態(tài)、VASN表達(dá)及分泌的影響

  更多相關(guān)文章： 乙醇 VASN 細(xì)胞遷移 細(xì)胞膜泡

【摘要】：原發(fā)性肝癌是一種常見(jiàn)的惡性腫瘤,其發(fā)病率居于腫瘤發(fā)病率的第六位,而病死率僅次于肺癌,我國(guó)肝癌患者占全球肝癌患者總數(shù)的一半以上,死亡率也居高不下。已確定誘發(fā)肝癌的因素包括乙肝或丙肝病毒感染、黃曲霉毒素、酒精等,新增的風(fēng)險(xiǎn)因素包括糖尿病、肥胖,非酒精性脂肪肝等。肝臟是乙醇代謝的主要器官,長(zhǎng)期過(guò)量飲酒嚴(yán)重?fù)p傷肝臟,導(dǎo)致脂肪肝、肝硬化,明顯增加肝癌的罹患率。第一部分:乙醇促進(jìn)HepG2細(xì)胞表達(dá)、分泌VASN蛋白及對(duì)HUVEC細(xì)胞遷移的影響。VASN蛋白是一種典型的Ⅰ型跨膜蛋白,包含串聯(lián)的亮氨酸結(jié)構(gòu)域,類表皮生長(zhǎng)因子結(jié)構(gòu)域和纖聯(lián)蛋白Ⅲ結(jié)構(gòu)域,其可以被金屬蛋白酶ADAM17剪切,從細(xì)胞膜上脫落分泌至細(xì)胞外,產(chǎn)生可溶性VASN蛋白(sVASN)。人VASN蛋白主要表達(dá)于主動(dòng)脈的血管平滑肌細(xì)胞、腎臟、胎盤組織等,其它組織中表達(dá)水平低。有報(bào)道顯示,乳腺癌細(xì)胞高表達(dá)VASN蛋白,其分泌的sVASN蛋白能夠抑制TGFβ信號(hào)通路的激活,發(fā)揮促腫瘤的作用。VASN在人腦腫瘤組織、細(xì)胞中高表達(dá),當(dāng)siRNA敲低膠質(zhì)細(xì)胞瘤中VASN表達(dá)水平,低氧或TNF-α誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡率明顯升高,提示VASN可能具有抗低氧誘導(dǎo)凋亡、促進(jìn)腫瘤進(jìn)展的作用。我們實(shí)驗(yàn)室前期工作中,利用SELEX技術(shù)從肝癌患者血清中篩選出潛在的肝癌生物標(biāo)志物VASN蛋白,并且證實(shí)VASN蛋白在肝癌細(xì)胞、肝癌組織中高表達(dá)。進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)表明,HepG2來(lái)源的外泌體形式VASN能夠促進(jìn)HUVEC細(xì)胞遷移。長(zhǎng)期慢性乙醇刺激導(dǎo)致HepG2細(xì)胞多種基因表達(dá)水平的改變,影響急性應(yīng)激反應(yīng)、氨基酸代謝,碳代謝以及脂質(zhì)代謝等途徑。本部分將利用乙醇刺激HepG2細(xì)胞,檢測(cè)VASN蛋白的表達(dá)變化及其可能對(duì)HUVEC細(xì)胞的影響。為模擬日常生活中的中度、重度飲酒以及酗酒,我們選取與之相對(duì)應(yīng)的25、50、100mM三種乙醇濃度對(duì)HepG2細(xì)胞進(jìn)行刺激。乙醇刺激不同時(shí)間(24、48、72h)后,我們提取細(xì)胞總RNA,qPCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)三種濃度乙醇刺激均可導(dǎo)致VASN蛋白的mRNA水平顯著上升;細(xì)胞總蛋白Western Blot結(jié)果顯示,三種濃度乙醇均促進(jìn)VASN蛋白表達(dá)。收集乙醇刺激后的上清進(jìn)行濃縮,檢測(cè)其中VASN蛋白水平,Western Blot結(jié)果顯示,上清中VASN蛋白水平在乙醇刺激后顯著上升。以上結(jié)果表明乙醇刺激可以促進(jìn)HepG2細(xì)胞VASN蛋白的表達(dá)與分泌。VASN蛋白不僅可以被金屬蛋白酶ADAM17剪切,胞外結(jié)構(gòu)域脫落成為sVASN;而我們前期工作發(fā)現(xiàn),VASN蛋白還存在于肝癌細(xì)胞分泌的外泌體中。乙醇刺激可以促進(jìn)HepG2細(xì)胞培養(yǎng)上清中VASN蛋白水平升高,究竟是何種形式的VASN分泌增加,我們進(jìn)行了探討。我們利用外泌體提取試劑從乙醇刺激的細(xì)胞培養(yǎng)上清中純化外泌體,同時(shí)收集去除外泌體的細(xì)胞上清。通過(guò)對(duì)外泌體進(jìn)行蛋白定量分析,結(jié)果顯示乙醇刺激后外泌體的總蛋白量顯著升高;同時(shí)westernblot檢測(cè)外泌體標(biāo)志分子hsp70蛋白水平,發(fā)現(xiàn)乙醇刺激后hsp70蛋白明顯上升,其結(jié)果與蛋白定量相一致,表明乙醇可以促進(jìn)hepg2細(xì)胞分泌外泌體。檢測(cè)外泌體中vasn蛋白,westernblot結(jié)果顯示乙醇處理組的外泌體中vasn蛋白水平升高。同時(shí)我們也檢測(cè)了去除外泌體的細(xì)胞上清中svasn水平,結(jié)果表明,乙醇刺激也可以促進(jìn)hepg2分泌svasn。我們進(jìn)一步研究乙醇促進(jìn)hepg2細(xì)胞表達(dá)分泌vasn蛋白,對(duì)于huvec細(xì)胞會(huì)產(chǎn)生怎樣影響。我們使用上述濃度乙醇刺激huvec細(xì)胞,結(jié)果發(fā)現(xiàn)huvec細(xì)胞的遷移明顯受到抑制。隨后,我們將hepg2細(xì)胞與huvec細(xì)胞共培養(yǎng),結(jié)果發(fā)現(xiàn),在乙醇刺激條件下,相對(duì)于單獨(dú)培養(yǎng)的huvec細(xì)胞,與正常hepg2細(xì)胞共培養(yǎng)的huvec細(xì)胞遷移速率明顯加快,細(xì)胞穿膜數(shù)量增加,而與敲低vasn的hepg2細(xì)胞共培養(yǎng)的huvec細(xì)胞遷移速率則無(wú)明顯變化,細(xì)胞穿膜數(shù)量顯著減少,說(shuō)明乙醇刺激hepg2細(xì)胞分泌vasn,而vasn在促進(jìn)huvec細(xì)胞遷移,趨化過(guò)程中發(fā)揮重要作用。上述結(jié)果提示,乙醇促進(jìn)hepg2細(xì)胞表達(dá)、分泌vasn蛋白,調(diào)節(jié)vasn蛋白介導(dǎo)的hepg2與huvec細(xì)胞間的“通訊”。本研究有助于闡明乙醇在肝癌發(fā)生發(fā)展中的作用;同時(shí),vasn作為肝癌組織微環(huán)境中的重要組分,也可能成為肝癌防治藥物的候選靶分子。第二部分:致死量乙醇短時(shí)間刺激hepg2細(xì)胞膜泡產(chǎn)生的初步觀察乙醇通過(guò)多種機(jī)制影響細(xì)胞的生命活動(dòng),不同濃度乙醇作用有所不同。100mm乙醇可以促進(jìn)肝癌細(xì)胞的遷移、腫瘤血管生成以及外泌體的分泌,而1.5m乙醇可以顯著增加胰腺導(dǎo)管腺癌細(xì)胞的細(xì)胞膜通透性,直接將無(wú)水乙醇注入肝癌腫瘤中央,可以使腫瘤細(xì)胞及附近血管內(nèi)皮細(xì)胞迅速脫水,引發(fā)細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)凝固變性,從而導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞壞死。細(xì)胞皮層(cellcortex)是一層富含肌動(dòng)蛋白的結(jié)構(gòu),緊貼細(xì)胞質(zhì)膜的細(xì)胞質(zhì)區(qū)域,牽引臨近的肌動(dòng)蛋白微絲,形成外膜張力。當(dāng)皮層與質(zhì)膜的結(jié)合處破壞或皮層溶解,細(xì)胞質(zhì)就會(huì)流向這些位點(diǎn),流體壓力導(dǎo)致質(zhì)膜膨出,形成“膜泡”(bleb)。細(xì)胞膜泡通常在細(xì)胞膜上可以發(fā)展到2μm,然后可以收縮至膜泡起始部位。膜泡見(jiàn)于許多細(xì)胞活動(dòng)過(guò)程,在細(xì)胞的三維運(yùn)動(dòng)中至關(guān)重要,如細(xì)胞運(yùn)動(dòng)、腫瘤細(xì)胞侵襲、凋亡、應(yīng)激反應(yīng)過(guò)程中。我們發(fā)現(xiàn)2m乙醇刺激hepg2細(xì)胞膜泡形成。我們對(duì)細(xì)胞膜泡進(jìn)行了形態(tài)學(xué)觀察,一部分細(xì)胞膜泡會(huì)隨著乙醇處理時(shí)間的延長(zhǎng)而在細(xì)胞膜表面發(fā)生融合、收縮,一部分細(xì)胞膜泡會(huì)從細(xì)胞表面脫落,懸浮在培養(yǎng)基中。我們對(duì)乙醇誘導(dǎo)細(xì)胞膜泡產(chǎn)生的濃度進(jìn)行摸索,結(jié)果顯示100mm、400mm乙醇長(zhǎng)期間刺激都不能誘導(dǎo)膜泡的生成,而在2m乙醇刺激10min時(shí),我們就可以觀察到大量細(xì)胞膜泡的產(chǎn)生。我們利用臺(tái)盼藍(lán)對(duì)2m乙醇刺激的膜泡細(xì)胞進(jìn)行染色,發(fā)現(xiàn)細(xì)胞膜通透性增強(qiáng);通過(guò)掃描電鏡觀察膜泡細(xì)胞,結(jié)果發(fā)現(xiàn)乙醇刺激使細(xì)胞表面變得粗糙,微絨毛消失,膜泡突出,膜泡細(xì)胞與基質(zhì)連接減弱,部分細(xì)胞表面出現(xiàn)孔洞。利用染料Dil與鬼筆環(huán)肽分別對(duì)細(xì)胞膜與肌動(dòng)蛋白進(jìn)行染色,熒光顯微鏡觀察,結(jié)果發(fā)現(xiàn)乙醇刺激后細(xì)胞膜泡從細(xì)胞膜上突出,變圓,膜泡內(nèi)含有細(xì)胞質(zhì)成分,但是不含有細(xì)胞骨架中的肌動(dòng)蛋白,說(shuō)明細(xì)胞膜脫離細(xì)胞骨架,致使細(xì)胞形態(tài)發(fā)生變化。最后,我們檢測(cè)了細(xì)胞膜泡率與細(xì)胞死亡率。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,細(xì)胞膜泡率與死亡率隨乙醇刺激時(shí)間的延長(zhǎng)而增加,結(jié)合對(duì)細(xì)胞形態(tài)學(xué)的分析,可以發(fā)現(xiàn),大部分膜泡細(xì)胞的最終命運(yùn)是死亡,但仍有極少數(shù)細(xì)胞存活,并且能夠繼續(xù)增殖。此外,我們收集了細(xì)胞外囊泡進(jìn)行檢測(cè),結(jié)果表明,2M乙醇明顯促進(jìn)細(xì)胞外囊泡的分泌,這些囊泡具有怎樣的生物學(xué)功能尚不明確。本部分初步探討了致死量乙醇對(duì)HepG2細(xì)胞的影響,我們發(fā)現(xiàn)2M乙醇誘導(dǎo)細(xì)胞外囊泡的分泌、膜泡形成、大量細(xì)胞死亡,但仍有少量膜泡細(xì)胞存活。今后我們將繼續(xù)研究產(chǎn)生乙醇“耐受”的膜泡細(xì)胞生物學(xué)特性與功能,膜泡與細(xì)胞外囊泡的組成及其生物學(xué)功能。
【關(guān)鍵詞】：乙醇 VASN 細(xì)胞遷移 細(xì)胞膜泡
【學(xué)位授予單位】：中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R735.7
【目錄】：

• 縮略詞表4-6
• 摘要6-9
• Abstract9-12
• 第一部分 乙醇促進(jìn)HepG2細(xì)胞表達(dá)、分泌VASN蛋白及對(duì)HUVEC細(xì)胞遷移的影響12-30
• 前言12-13
• 1.1 實(shí)驗(yàn)材料13-17
• 1.2 實(shí)驗(yàn)方法17-20
• 1.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果20-28
• 1.4 討論28-29
• 1.5 結(jié)論29-30
• 第二部分 致死量乙醇短時(shí)間刺激HepG2細(xì)胞膜泡產(chǎn)生的初步觀察30-43
• 前言30-31
• 2.1 實(shí)驗(yàn)材料31-32
• 2.2 實(shí)驗(yàn)方法32-34
• 2.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果34-41
• 2.4 討論41-42
• 2.5 結(jié)論42-43
• 參考文獻(xiàn)43-46
• 綜述46-51
• 參考文獻(xiàn)49-51
• 致謝51-52
• 附錄Ⅰ：個(gè)人簡(jiǎn)歷52-53

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1 孫樂(lè)橋;乙醇對(duì)HepG2細(xì)胞形態(tài)、VASN表達(dá)及分泌的影響[D];中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院;2016年

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本文編號(hào)：935743