本文關鍵詞：TAGLN2在食管鱗癌診斷和術后生存期預警中的臨床意義

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【摘要】：背景食管癌(Esophageal cancer,EC)發(fā)病率和死亡率分別居全球所有癌癥發(fā)病率和死亡率的第八位和第六位。中國每年EC新增及死亡患者居世界首位,食管鱗狀細胞癌(Esophageal squamous cell carcinoma,ESCC)占所有EC 90%以上。近幾十年來,ESCC多學科綜合治療取得了巨大進展,但ESCC預后差,外科根治性手術后五年生存率仍低于30%。ESCC預后差的主要原因是首次確診的ESCC時已發(fā)展至疾病的中晚期,并且50%的病人已發(fā)生遠處轉移。TAGLN2(Transgelin2,轉凝蛋白)屬Calponin家族成員之一,是平滑肌22alpha(Smooth muscle 22alpha,SM-22α)的同源蛋白,TAGLN2蛋白參與細胞應力纖維構成,與肌動蛋白相互作用維持其穩(wěn)定性。研究表明TAGLN2在肺癌、結直腸癌、胰腺癌、宮頸鱗狀細胞癌及頭頸鱗狀細胞癌中高表達,但在乳腺癌、肝細胞癌及食管腺癌中常低表達。Hippo信號通路是腫瘤抑制性通路之一,該通路失活能夠導致Hippo信號通路主要靶分子YAP、TAZ的活性升高,進一步促進腫瘤細胞增殖、遷移及侵襲。本研究分析了TAGLN2、YAP和TAZ在ESCC中的表達相關性,深入理解TAGLN2與ESCC臨床病理特征的相關性及在ESCC發(fā)生、演進中的作用。目的分析TAGLN2在正常食管上皮細胞組織(Normal esophageal epithelium,NEE),低級別上皮內瘤變組織(Low grade intraepithelial neoplasia,LGIN),高級別上皮內瘤變組織(High grade intraepithelial neoplasia,HGIN)及不同TNM分期的ESCC組織中的表達特征,闡明TAGLN2表達變異與ESCC患者的臨床病理指標的相關性及與ESCC根治性切除手術后整體生存率的關系,明確TAGLN2在ESCC發(fā)生及演進中的作用;并分析TAGLN2與YAP、TAZ在ESCC中的表達相關性。1材料與方法1.1實驗細胞及組織食管上皮永生化細胞NEC、NE6及ESCC細胞系NE3、EC1、TE1、EC9706均來自河南大學醫(yī)學院細胞與分子免疫學重點實驗室;100例TNM I-IV期患者ESCC及對應癌旁組織(每期25例)均來自林州市腫瘤醫(yī)院病理科2010年-2012年底收集的組織樣本;162例五年隨訪ESCC術后患者,86例購自上海芯超組織芯片公司,另76例來自河南大學附屬醫(yī)院淮河醫(yī)院2007年-2012年隨訪的ESCC患者,所有ESCC患者術前未接受任何化學治療或放射治療。1.2實驗方法1.2.1 RT-PCR分別提取ESCC各期及對應癌旁組織mRNA,每期25對,測mRNA濃度,反轉錄采用Promega A3800 Im Prom II?Reverse Transcription試劑盒進行,反應體系為20 ul,包括Mg Cl2、5×buffer、引物、RNA酶抑制劑、反轉錄酶,在全自動擴增儀上將mRNA反轉錄成c DNA;配制RT-PCR反應體系20 ul,包括2×Ultra SYBR Mixture(with ROX)、引物、DEPC水及c DNA,95℃解鏈、58℃退火、72℃延伸,定量檢測TAGLN2 mRNA在ESCC TNM各期組織及癌旁組織中的差異表達。1.2.2 Western blot所有組織及細胞均用2D裂解液提取蛋白,包括癌前病變各期組織蛋白(NEE、LGIN、HGIN各5例),ESCC(Ⅰ-Ⅳ期)及對應癌旁組織各25對。細胞包括NEC、NE6、EC1、TE1、NE3、EC9706細胞系,Bradford法檢測蛋白濃度。每孔30μg蛋白在SDS-PAGE中電泳分離各分子量蛋白。將蛋白轉印至PVDF膜,5%脫脂牛奶室溫封閉1h,一抗按抗體推薦濃度TBST稀釋,4℃孵育過夜,二抗按推薦濃度TBST稀釋配制,室溫平搖1h,加增強型ECL發(fā)光劑曝片檢測目的條帶,Western blot結果半定量分析采用Quantity One軟件進行。1.2.3免疫組織化學染色及半定量分析免疫組織化學染色(Immunohistochemical,IHC)方法檢測110例ESCC病變前各階段活檢組織和162例五年隨訪ESCC患者組織及癌旁組織中TAGLN2的差異表達。IHC染色評分首先根據細胞染色強度進行評分。再根據免疫染色陽性細胞數占組織總細胞數的百分比評分。最終兩次統(tǒng)計分值相乘,即為IHC分值。1.2.4穩(wěn)定細胞株構建應用慢病毒穩(wěn)轉技術對NE6細胞過表達TAGLN2,對ESCC細胞系9706沉默TAGLN2,構建亞細胞系NE6-T2及對照細胞、9706-sh-T2及對照細胞。1.2.5細胞核質分離蛋白檢測參照NE-PER nuclear and cytoplasmic extraction reagents試劑盒說明書進行細胞核質分離,采用Western blot檢測細胞核、細胞質蛋白。1.3統(tǒng)計學分析方法統(tǒng)計學分析均采用SPSS17.0軟件分析。T-test統(tǒng)計檢驗兩組間差異,RT-PCR、Western blot檢測條帶及IHC檢測結果存在有序變量時采用Mann-whitney或Wilcoxon檢驗;卡方檢驗的Gamma test檢驗參數間的相關性;卡方檢驗或Fisher精確檢驗分析ESCC患者臨床病理指標與TAGLN2表達的相關性;Kaplan-Meier法繪制生存曲線,各組間的比較采用Logrank檢驗,Cox回歸模型分析ESCC預后影響因素。檢驗水準為P0.05。2結果2.1 TAGLN2 mRNA在ESCC組織中高于相應癌旁組織(P0.05),且TAGLN2 mRNA表達水平升高與ESCC發(fā)展存在正相關(P0.05),TAGLN2 mRNA表達水平隨著ESCC發(fā)展而升高。2.2從NEE發(fā)展至LGIN,再至HGIN病變,TAGLN2表達逐漸升高;隨ESCC臨床TNM分期進展,TAGLN2的表達也逐漸升高;TAGLN2蛋白在食管上皮永生化細胞NEC、NE6中的表達均低于ESCC細胞系。2.3 IHC染色結果顯示TAGLN2在ESCC組織細胞中高表達,主要定位于細胞膜及細胞質中,在癌旁組織中呈低表達;從NEE到LGIN,再從LGIN到HGIN組織中TAGLN2的表達逐漸升高(P0.05),TAGLN2從HGIN到ESCC中表達差異不明顯;TAGLN2表達水平與ESCC癌前病變進展及ESCC各期進展呈正相關;TAGLN2蛋白表達與淋巴轉移及TNM分期呈正相關(P0.05);而與性別、年齡、T-stage、分化程度無顯著相關性(P0.05)。2.4 TAGLN2及各臨床病理資料與根治性手術后生存期的相關性TAGLN2表達升高與ESCC患者術后五年總體生存率呈負相關(P0.05);在TNMⅠ-Ⅱ期ESCC中TAGLN2表達升高與患者術后五年生存率呈正相關(P0.05),而在TNMⅢ-Ⅳ期TAGLN2的表達與ESCC患者術后五年總體生存率無顯著相關性(P0.05)。2.5影響ESCC預后的單因素、多因素分析單因素Cox回歸分析結果顯示:患者性別、侵襲深度、淋巴結轉移、TNM分期、TAGLN2表達水平是影響ESCC患者術后總體生存期的重要因素(P0.05),還不能認為年齡、病理分期能影響ESCC術后總體生存期(P0.05);Cox多因素回歸分析顯示:TAGLN2是ESCC術后獨立危險因素(P0.05),性別、浸潤深度分級、淋巴結轉移與否、臨床TNM分期尚不能認為是ESCC預后的獨立危險因素(P0.05)。2.6 TAGLN2與YAP/TAZ相關性YAP、TAZ蛋白在ESCC組織中表達高于癌旁組織,T檢驗蛋白條帶的半定量分析顯示差異顯著(P0.05)。TAZ與TAGLN2同時在癌中升高比例達75%,YAP與TAGLN2同時升高比例達到62.5%,表明TAGLN2與YAP、TAGLN2與TAZ存在正相關性。NE6-T2及9706-sh-T2亞細胞系與其對應對照細胞的細胞核內YAP/TAZ蛋白相比顯著降低。3結論3.1 TAGLN2表達變異發(fā)生于ESCC癌前病變,并隨ESCC發(fā)展逐漸升高,TAGLN2可能是ESCC分子診斷、預防和治療分子靶點之一;3.2 TAGLN2表達水平與ESCC的臨床分期呈正相關,與ESCC術后五年總體生存率存在負相關,且是ESCC術后生存期的獨立危險因素之一。TAGLN2可能是ESCC術后生存期預警評估分子之一。3.3 TAGLN2與Hippo信號通路中的靶分子YAP和TAZ表達呈正相關性,且TAGLN2促進YAP/TAZ入核。TAGLN2可能通過影響YAP和TAZ的入核增多促進了ESCC演進。
【關鍵詞】：食管鱗狀細胞癌 TAGLN2 預后 YAP TAZ
【學位授予單位】：河南大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R735.1
【目錄】：

• 摘要4-8
• ABSTRACT8-15
• 縮略詞表15-16
• 前言16-20
• 1.實驗材料、試劑與儀器20-28
• 1.1 實驗研究所用的細胞及組織20
• 1.2 使用主要試劑及配制20-26
• 1.3 實驗主要儀器26-28
• 2.實驗方法28-36
• 2.1 蛋白提取28
• 2.2 蛋白濃度檢測28
• 2.3 WESTERN BLOT檢測大分子蛋白（>15KB）28-30
• 2.4 WESTERN BLOT檢測小分子蛋白（<15KB）30
• 2.5 組織及細胞RNA提取30-31
• 2.6 RNA反轉錄31
• 2.7 瓊脂糖凝膠電泳31
• 2.8 RT-PCR31-32
• 2.9 免疫組織化學染色32
• 2.10 免疫組織化學染色評分32-33
• 2.11 慢病毒細胞轉染技術構建穩(wěn)定亞細胞株33
• 2.12 細胞核質分離檢測33
• 2.13 統(tǒng)計分析33-36
• 3 結果36-50
• 3.1 TAGLN2 mRNA在ESCC患者各期組織及對應癌旁組織中的差異表達36-37
• 3.2 WESTERN BLOT檢測TGALN2在正常食管黏膜、癌前病變及各臨床分期ESCC中的表達37-38
• 3.3 IHC檢測TGALN2在正常食管黏膜、癌前病變及各臨床分期ESCC中的表達38-42
• 3.4 TAGLN2與術后生存時間的相關性42-44
• 3.5 COX單因素及多因素統(tǒng)計分析影響ESCC病人根治性術后不良預后的獨立風險因素44-45
• 3.6 TAGLN2、YAP和TAZ在食管上皮永生化細胞及癌細胞系中的表達45-46
• 3.7 ESCC組織中TAGLN2與YAP、TAZ間的相關性46-47
• 3.8 TAGLN2促進食管正常永生化上皮細胞NE6及ESCC細胞系9706中YAP/TAZ入核47-50
• 4 討論50-54
• 5 結論54-56
• 參考文獻56-62
• 綜述 Hippo信號通路在腫瘤發(fā)生及演進的研究進展62-78
• 參考文獻74-78
• 致謝78-80
• 攻讀碩士學位期間發(fā)表論文及獲得獎勵情況80-81

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本文編號：934632