本文關(guān)鍵詞：TLR7激動劑Loxoribine抑制腫瘤生長的免疫學(xué)機制研究

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【摘要】：目的:腫瘤局部存在多種類型的免疫抑制性細胞,其中調(diào)節(jié)性T細胞(regulatory T cell,Tregs)在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著重要的作用。Tregs在不同腫瘤中的表達都有不同程度的增高,諸如肺癌、乳腺癌、肝癌、卵巢癌、胃癌、淋巴瘤等均發(fā)現(xiàn)有這群細胞的存在,腫瘤局部Tregs的數(shù)量與腫瘤的預(yù)后密切相關(guān)。Tregs通過多種機制誘導(dǎo)免疫抑制效應(yīng),是腫瘤免疫逃逸的重要調(diào)控因素,因此抑制Tregs的免疫抑制效應(yīng)是免疫治療的關(guān)鍵步驟。本課題通過CT26小鼠結(jié)腸癌和LLC Lewis小鼠肺癌模型,探討了TLR7受體的激動劑Loxoribine抑制腫瘤生長的免疫學(xué)機制。方法:1)通過CT26小鼠結(jié)腸癌細胞和LLC lewis小鼠肺癌細胞構(gòu)建荷瘤小鼠模型,模型構(gòu)建成功后,以每只荷瘤小鼠1umol的Loxoribine進行腹腔注射,對照組注射PBS(9.8%DMSO),隔3天注射1次,持續(xù)3周。觀察Loxoribine對小鼠體內(nèi)腫瘤生長的影響。2)通過細胞增殖實驗(CCK8)檢測Loxoribine對CT26小鼠結(jié)腸癌細胞和LLC Lewis小鼠肺癌細胞是否有直接殺傷作用。3)通過RT-PCR檢測TLR7在CT26小鼠結(jié)腸癌細胞和LLC Lewis小鼠肺癌細胞中是否表達。4)SCID小鼠是一種缺乏T淋巴細胞和B淋巴細胞的免疫缺陷小鼠,但先天免疫完整。為了明確Loxoribine是否通過激活先天免疫發(fā)揮抑制腫瘤的作用,進一步構(gòu)建CT26小鼠結(jié)腸癌和LLC Lewis小鼠肺癌的SCID小鼠荷瘤模型,然后分別以Loxoribine和PBS(9.8%DMSO)進行腹腔注射,隔3天注射1次,持續(xù)3周。觀察Loxoribine是否抑制體內(nèi)腫瘤的生長,以明確Loxoribine是否通過激活先天免疫發(fā)揮抑制腫瘤生長的作用。5)通過磁珠分選(MACS)的方法分選出CT26小鼠結(jié)腸癌荷瘤小鼠、LLC Lewis小鼠肺癌荷瘤小鼠以及對照小鼠脾臟、骨髓中CD4+T細胞,DCs和Tregs,通過淋巴細胞增殖實驗檢測Loxoribine處理后對淋巴細胞增殖的影響。6)通過MACS分選TLR7基因敲除小鼠(TLR7-/-)和對照組小鼠脾臟、骨髓中CD4+T細胞,DCs和Tregs,經(jīng)Loxoribine刺激后檢測其對淋巴細胞增殖的影響。7)通過流式細胞術(shù)檢測Loxoribine對DCs成熟的影響。8)建立Transwell共培養(yǎng)體系(上層加入Tregs,下層加入DCs),在共培養(yǎng)體系中加入Loxoribine觀察其對DCs細胞因子分泌的影響。9)使用ELISA方法對Loxoribine處理后的DCs進行細胞因子分泌量的檢測并使用相應(yīng)細胞因子的中和抗體進行中和,驗證該細胞因子的作用。將Loxoribine處理后的DCs對小鼠靜脈注射,觀察其對小鼠腫瘤生長的抑制作用。結(jié)果:1)通過CT26小鼠結(jié)腸癌和LLC Lewis小鼠肺癌荷瘤模型發(fā)現(xiàn),與PBS(9.8%DMSO)注射組相比,Loxoribine注射組小鼠皮下腫瘤生長顯著緩慢,表明Loxoribine能夠抑制腫瘤的體內(nèi)生長。2)RT-PCR結(jié)果顯示,CT26小鼠結(jié)腸癌細胞和LLC Lewis小鼠肺癌細胞中均不表達TLR7。通過細胞增殖實驗(CCK8)發(fā)現(xiàn),Loxoribine對CT26小鼠結(jié)腸癌細胞和LLC Lewis小鼠肺癌細胞無直接殺傷作用。3)通過SCID免疫缺陷小鼠荷瘤模型發(fā)現(xiàn),Loxoribine處理組和對照組小鼠體內(nèi)腫瘤生長無顯著性差別,表明Loxoribine并不是通過激活先天性免疫而發(fā)揮抑制腫瘤生長的作用。4)通過MACS分選荷瘤組和對照組小鼠體內(nèi)CD4+T細胞,DCs和Tregs,淋巴細胞增值實驗結(jié)果顯示,與未經(jīng)Loxoribine處理的荷瘤小鼠和對照組小鼠相比,使用Loxoribine處理后的荷瘤小鼠體內(nèi)Tregs不能抑制CD4+T細胞的增殖。5)淋巴細胞增殖實驗發(fā)現(xiàn),當(dāng)CD4+T細胞,Tregs或DCs單獨培養(yǎng)時,Loxoribine對其增殖沒有直接影響;然而當(dāng)CD4+T/DCs或Tregs/DCs混合培養(yǎng),Loxoribine可以明顯促進CD4+T細胞或Tregs的增殖,而對CD4+T/Tregs混合培養(yǎng)組細胞的增殖沒有影響,表明TLR7的激動劑Loxoribine通過DCs促進CD4+T細胞和Tregs增殖。6)在CD4+T/DCs/Tregs的培養(yǎng)體系中加入Loxoribine發(fā)現(xiàn),Loxoribine逆轉(zhuǎn)Tregs對CD4+T細胞的抑制作用,而這一作用是通過DCs介導(dǎo)的。7)分選野生型和TLR7基因敲除小鼠體內(nèi)CD4+T細胞、DCs和Tregs,通過淋巴細胞增殖實驗發(fā)現(xiàn),TLR7在DCs中的表達是Loxoribine促進CD4+T細胞增殖和逆轉(zhuǎn)Tregs免疫抑制功能所必需的。8)流式細胞術(shù)分析結(jié)果顯示Loxoribine對DCs上CD80、CD86等分子表達沒有影響,表明Loxoribine不能誘導(dǎo)DCs的成熟。8)ELISA結(jié)果顯示,Loxoribine可以促進DCs分泌多種細胞因子,其中IL-6表達變化最為明顯,中和IL-6表達后可以顯著抑制Loxoribine對CD4+T細胞和Tregs的作用,表明DCs通過分泌IL-6調(diào)控Tregs。9)將Loxoribine處理的DCs靜脈注射荷瘤小鼠后,可以顯著抑制腫瘤的生長。結(jié)論:Loxoribine能顯著抑制CT26小鼠結(jié)腸癌細胞和LLC Lewis小鼠肺癌細胞在體內(nèi)的生長,這種抑制效應(yīng)并不是通過直接殺傷作用和激活先天性免疫而實現(xiàn),而是通過DCs釋放可溶性細胞因子IL-6促進CD4+T細胞的增殖并逆轉(zhuǎn)Tregs的免疫抑制功能。
【關(guān)鍵詞】：TLR7 調(diào)節(jié)性T細胞 免疫抑制 抑瘤效應(yīng)
【學(xué)位授予單位】：上海交通大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R730.5
【目錄】：

• 摘要6-9
• Abstract9-12
• 英文縮略語表12-14
• 緒論14-17
• 第一部分 Loxoribine抑制結(jié)腸癌和肺癌在體內(nèi)的生長17-34
• 引言17-18
• 材料與方法18-26
• 結(jié)果26-31
• 討論31-34
• 第二部分 Loxoribine通過DCs促進CD4+T細胞增殖和逆轉(zhuǎn)Tregs的免疫抑制功能34-48
• 引言34
• 材料與方法34-39
• 結(jié)果39-45
• 討論45-48
• 第三部分 Loxoribine通過DCs釋放IL-6 來發(fā)揮作用48-61
• 引言48
• 材料與方法48-55
• 結(jié)果55-59
• 討論59-61
• 結(jié)論61-62
• 參考文獻62-68
• 致謝68-70
• 已發(fā)表文章70

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8 李U，

本文編號：934613