本文關(guān)鍵詞：白藜蘆醇增敏卡非佐米對多發(fā)性骨髓瘤細胞的殺傷作用及其機制研究

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【摘要】：目的:1.探究白藜蘆醇(resveratrol,RSV)對多發(fā)性骨髓瘤(multiple myeloma,MM)細胞增殖活力的影響。2.探究RSV能否增敏卡非佐米(carfilzomib,CFZ)對MM細胞的殺傷作用及增敏的可能機制,為CFZ聯(lián)合RSV應(yīng)用于MM的治療提供一定的實驗基礎(chǔ)。3.探究RSV聯(lián)合CFZ作用MM細胞后細胞內(nèi)自噬水平的變化,并且通過抑制自噬途徑觀察MM細胞凋亡水平的變化,為進一步提高增敏作用提供新的思路。方法:1.MTT法檢測RSV對MM細胞增殖活力的影響:以4種MM細胞株LP-1、U266、MM.1S、MM.1R為研究對象,用不同濃度梯度的RSV孵育MM細胞24 h后,采用MTT比色法檢測細胞增殖活力的變化。然后用最小抑制濃(minimum inhibitory concentration,MIC)分別處理各細胞株24 h、48 h、72 h后觀察細胞增殖活力的變化。2.MTT法檢測RSV預(yù)處理前后CFZ對MM細胞生長抑制作用的變化:根據(jù)方法1的實驗結(jié)果,選擇對RSV最敏感的MM細胞株LP-1為研究對象。將實驗分為兩組:組1用50μmol/L RSV預(yù)處理LP-1細胞24 h后,移除RSV換新的培養(yǎng)基后,再給予不同濃度CFZ處理24 h;組2直接用不同濃度梯度的CFZ孵育LP-1細胞24 h,MTT實驗檢測CFZ對MM細胞的增殖抑制作用,并分別得出組1與組2的CZF的IC50。3.流式細胞術(shù)測周期實驗檢測細胞周期的變化:將實驗分設(shè)為四組:對照組、RSV組、CFZ組、RSV+CFZ組。對照組:不給予處理;RSV組:50μmol/L RSV孵育LP-1細胞24 h;CFZ組:40nmol/L CFZ孵育細胞24 h;RSV+CFZ組:50μmol/L RSV預(yù)處理LP-1細胞24 h后,移除RSV后并再給予CFZ 40 nmol/L孵育24 h。收集細胞PI染色上流式機檢測細胞周期的變化。4.流式細胞術(shù)測凋亡實驗檢測MM細胞凋亡率的變化:同方法3將實驗分設(shè)為4組,給予不同的處理后收集細胞FITC/PI染色上流式機檢測各組細胞凋亡率。5.流式細胞術(shù)測活性氧(reactive oxygen species,ROS)實驗檢測ROS變化:同方法3將實驗分設(shè)為4組,給予LP-1細胞不同的處理后收集細胞加入熒光探針DCFH-DA,采用流式細胞術(shù)檢測各組細胞內(nèi)ROS水平。6.加入活性氧清除劑N-乙酰半胱氨酸(N-Acetylcysteine,NAC)及自噬抑制劑3-甲基腺嘌呤(3-methyl adenine,3-MA)后MM細胞內(nèi)ROS的變化及凋亡的變化:實驗分設(shè)為8組,分別為對照組、RSV組、CFZ組、RSV+CFZ組、NAC組、NAC+RSV+CFZ組、3-MA組、3MA+RSV+CFZ組,3 mmol/L NAC預(yù)處理LP-1細胞2 h后,1 mmol/L 3-MA預(yù)處理LP-1細胞1 h后,再給予方法4、5處理,采用流式細胞術(shù)檢測各組ROS水平及凋亡率的變化。7.Western bloting實驗檢測兩藥聯(lián)合作用凋亡相關(guān)蛋白及自噬相關(guān)蛋白LC3I/II的表達水平以及加入3-MA后自噬及凋亡相關(guān)蛋白的表達變化;同方法3將實驗分為4組,給予不同的處理后收集細胞,采用Western bloting檢測細胞周期相關(guān)蛋白p38 MAPK、抗凋亡蛋白survivin,Sirt1以及促凋亡蛋白smac、caspase 3的表達水平,同時檢測自噬相關(guān)蛋白LC3 I/II的表達變化。加入自噬抑制劑3-MA后再給予RSV+CFZ后LC3 I/II及caspase 3的表達變化。8.Smac的小干擾RNA(si RNA)轉(zhuǎn)染細胞后檢測凋亡相關(guān)蛋白的表達水平:將實驗分設(shè)為4組:對照組、RSV+CFZ組、si RNA、si RNA+RSV+CFZ組,采用Western bloting檢測抗凋亡蛋白survivn,sirt-1以及促凋亡蛋白Smac、的表達水平。9.所有實驗數(shù)據(jù)均采用SPSS17.0統(tǒng)計學(xué)軟件、Graph Pad Prism 5進行數(shù)據(jù)分析,采用Graph Pad Prism 5作圖,Photoshop對Western blotting進行整理、分析,P0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。結(jié)果:1.MTT實驗結(jié)果得出:RSV對4種MM細胞株LP-1、U266、MM.1S、MM.1R均具有生長抑制作用,并且隨著濃度增加,抑制作用逐漸增強(n=3,P0.05)。以各自MIC分別處理細胞24、48、72 h,隨著時間的延長,生長抑制作用逐漸增強(n=3,P0.05)。CFZ對LP-1細胞具有生長抑制作用,并且隨著藥物濃度增加,抑制作用增強,IC50-1為8.45±0.76 nmol/L;以RSV預(yù)處理后的LP-1細胞為實驗對象,給予不同濃度CFZ處理,IC50-2為為6.92±1.78 nmol/L。2流式細胞術(shù)測細胞周期結(jié)果得出:與對照組相比,RSV組在G0/G1期、S期細胞比例增高,CFZ組、RSV+CFZ組在S期、G2/M期細胞比例增高。與CFZ組相比,RSV+CFZ組在G2/M期細胞比例增高(P0.01)。3.流式細胞術(shù)測凋亡實驗得出:對照組、RSV組、CFZ組、RSV+CFZ組凋亡率(%)分別為9.07±2.60、11.63±4.70、42.50±2.31、74.93±5.01;CFZ組、RSV+CFZ組的凋亡率高于對照組、RSV組,且CFZ+RSV組的凋亡率高于CFZ組,差異具有明顯統(tǒng)計學(xué)意義(P0.001)。4.流式細胞術(shù)測ROS實驗得出:RSV組、CFZ組、RSV+CFZ組、3-MA組、3-MA+RSV+CFZ組、NAC組、NAC+RSV+CFZ組ROS水平為對照組的0.98±0.72、1.02±0.72、1.32±0.23、1.18±0.05、1.32±0.16、0.83±0.14、1.14±0.19倍;與對照組相比,RSV+CFZ組、3-MA+RSV+CFZ組ROS水平均升高(P0.05);與CFZ組相比,RSV+CFZ組ROS水平升高(P0.05);與RSV+CFZ組相比,NAC+RSV+CFZ組ROS水平降低,3-MA+RSV+CFZ組ROS水平升高,但均未有統(tǒng)計學(xué)差異,P值分別為0.128,0.998。5.自噬抑制劑預(yù)處理前后RSV+CFZ組凋亡率的變化:對照組、RSV+CFZ組、3-MA組、3-MA+RSV+CFZ組凋亡率(%)分別為10.37±3.41、77.10±2.98、9.63±0.32、90.13±8.24;3-MA+RSV+CFZ組的凋亡率高于CFZ+RSV,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.01)。6 NAC預(yù)處理前后RSV+CFZ組凋亡率的變化:對照組、RSV+CFZ組、NAC組、NAC+RSV+CFZ組凋亡率(%)分別為8.03±1.36、69.67±1.59、8.87±0.90、63.70±1.64;RSV+CFZ組、NAC+RSV+CFZ組凋亡率均高于對照組及NAC組(P0.001);NAC+RSV+CFZ組的凋亡率低于CFZ+RSV組,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.01)。7.WB實驗證實RSV+CFZ組p38、smac、caspase 3表達升高,survivin、sirt-1表達減少,以及自噬相關(guān)蛋白LC3 I/II表達增高。加入自噬抑制劑后,3-MA+RSV+CFZ組LC3 I/II表達下降,caspase 3剪切體減少。與RSV+CFZ組相比,si RNA+RSV+CFZ組smac、Sirt-1表達水平下降,survivin表達未有明顯變化。結(jié)論:RSV可增敏CFZ對MM細胞的殺傷作用,主要表現(xiàn)為生長抑制及促凋亡作用增強。首先,生長抑制作用增強可能是ROS/p38MAPK信號通路激活從而使G2/M周期阻滯增強來實現(xiàn)。其次,促凋亡作用可能是通過ROS/sirt-1及smac/survivin兩條相互代償?shù)男盘柾钒l(fā)揮作用。此外,兩藥聯(lián)合作用產(chǎn)生保護性的自噬現(xiàn)象,阻斷自噬可進一步增強RSV聯(lián)合CFZ的促凋亡作用,因此,RSV、CFZ以及自噬抑制劑的聯(lián)合應(yīng)用為MM的臨床治療提供一定的實驗基礎(chǔ)。
【關(guān)鍵詞】：多發(fā)性骨髓瘤 白藜蘆醇 卡非佐米 凋亡 自噬
【學(xué)位授予單位】：天津醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R733.3
【目錄】：

• 中文摘要4-8
• Abstract8-12
• 縮略語/符號說明12-13
• 前言13-17
• 研究現(xiàn)狀、成果13-15
• 研究目的、方法15-17
• 對象和方法17-37
• 1.1 材料、試劑、儀器17-22
• 1.1.1 細胞系17
• 1.1.2 主要實驗試劑及耗材17-18
• 1.1.3 細胞培養(yǎng)耗材18-19
• 1.1.4 主要試劑緩沖液的配置19-22
• 1.2 實驗方法22-37
• 1.2.1 操作前準(zhǔn)備22
• 1.2.2 細胞培養(yǎng)22-24
• 1.2.3 MTT比色法測定RSV對MM細胞增殖的抑制率24-25
• 1.2.4 MTT實驗檢測RSV預(yù)處理前后CFZ對MM細胞的生長抑制作用25
• 1.2.5 流式細胞術(shù)測細胞周期實驗檢測RSV及RSV預(yù)處理前后CFZ對MM細胞細胞周期的影響25-26
• 1.2.6 流式測凋亡（FITC/PI）實驗分別檢測RSV、CFZ以及兩藥聯(lián)合對MM細胞的促凋亡作用26-27
• 1.2.7 加入活性氧抑制劑N-乙酰半胱氨酸（ N-Acetylcysteine，NAC）及自噬抑制劑 3-甲基腺嘌呤（3- methyl adenine，3-MA）后MM細胞內(nèi)ROS的變化及凋亡率的變化27-29
• 1.2.8 蛋白質(zhì)印跡法檢測RSV預(yù)處理前后凋亡及自噬相關(guān)蛋白的表達水平29-36
• 1.2.9 統(tǒng)計學(xué)分析36-37
• 實驗結(jié)果37-50
• 2.1 RSV抑制MM細胞的增殖37-39
• 2.2 RSV預(yù)處理前后CFZ對MM細胞增殖抑制作用及細胞周期的變化39-41
• 2.3 RSV預(yù)處理前后CFZ對MM細胞的促凋亡作用41-42
• 2.4 自噬抑制劑預(yù)處理前后RSV+CFZ組凋亡率的變化42-44
• 2.5 細胞內(nèi)ROS變化及加入活性氧清除劑NAC后凋亡率的變化44-48
• 2.6 RSV預(yù)處理前后CFZ引起MM細胞后凋亡及自噬相關(guān)蛋白的表達情況48-50
• 討論50-53
• 結(jié)論53-54
• 參考文獻54-60
• 發(fā)表論文和參加科研情況說明60-61
• 綜述 白藜蘆醇與多發(fā)性骨髓瘤相關(guān)性的研究進展61-69
• 綜述參考文獻65-69
• 致謝69-71
• 個人簡歷71

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本文編號：933216