本文關(guān)鍵詞：AZD5363對肝癌細(xì)胞的作用及其機(jī)制研究

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【摘要】：1研究目的(1)通過研究AKT信號通路抑制劑AZD5363對Hep-G2和Huh-7細(xì)胞系的影響,觀察肝癌細(xì)胞的細(xì)胞增殖及侵襲遷移能力的影響；(2)通過探究AZD5363對Hep-G2和Huh-7細(xì)胞系A(chǔ)KT信號通路蛋白表達(dá)水平的影響,觀察AZD5363對肝癌細(xì)胞AKT信號通路的影響；(3)通過探究AZD5363對Hep-G2和Huh-7細(xì)胞系mTOR蛋白及SMG-1蛋白表達(dá)水平的影響,探究AZD5363作用于肝癌細(xì)胞的機(jī)制。2實(shí)驗(yàn)方法2.1細(xì)胞培養(yǎng)人肝癌細(xì)胞系Hep-G2、Huh-7均來自山東大學(xué)附屬山東省立醫(yī)院肝病中心。Hep-G2和Huh-7細(xì)胞系在含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)。所有的細(xì)胞均在37℃,5%C02的濕潤的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。2.2細(xì)胞增殖能力測定細(xì)胞生長速率通過細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒-8(CCK-8)(Dojindo Corp)進(jìn)行測定。將細(xì)胞接種在細(xì)胞密度為1000-2000廚L的96孑L板中培養(yǎng)過夜,每孔中含90 μ 1培養(yǎng)基,然后用不同濃度的AZD5363作用各種肝癌細(xì)胞系24h,48h和72h。而后根據(jù)說明書每個(gè)孔中加入10 μ 1的CCK-8試劑。根據(jù)每種細(xì)胞的實(shí)際情況在孵箱中培養(yǎng)1～3h后,通過測量450nnm處的吸光度來確定細(xì)胞活力。2.3細(xì)胞遷移能力測定細(xì)胞經(jīng)胰蛋白酶消化處理后,加入無血清培養(yǎng)基(含0.1% BSA)制備細(xì)胞懸液,按細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果調(diào)整細(xì)胞密度,將Transwell小室放入24孔板中。上室加入含細(xì)胞的無血清的培養(yǎng)基200 u 1,下室加入750 μ 1含10%FBS的培養(yǎng)基,每組3個(gè)復(fù)孔,取出Transwell小、室,經(jīng)PBS沖洗后用棉簽擦去微孔膜上層的細(xì)胞,10%PBS甲醛固定l0min,甲醇浸泡l0min,而后1%吉姆薩染色30min。于顯微鏡下隨機(jī)計(jì)數(shù)3個(gè)視野(×400)內(nèi)的染色的細(xì)胞數(shù),并以此評價(jià)肝癌細(xì)胞的遷移能力。2.4 Western blot分析將細(xì)胞接種于6孔板中,經(jīng)藥物處理后提取蛋白,添加RIPA和PMSF的混合物(RIPA:PMSF=100:1) ( Beyotime Biotechnology),樣品蛋白濃度由BCA蛋白定量檢測試劑盒(Thermo Scientific)測定,隨后每個(gè)樣品各取約50μg用于蛋白免疫印跡分析。蛋白質(zhì)在SDS-聚丙烯酰胺凝膠中電泳分離,而后轉(zhuǎn)移到NC膜。一抗在4℃下孵育過夜,二抗在室溫下輕搖孵育2^后成像分析。除GAPDH購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司,所有一抗購自Cell Signaling公司,包括phosphor-mTOR (ser2448) (D9C2) (#5536S), phosphor-Akt (Thr450) D5G4 (#12178), phosphor-GSK-3β (ser9) (5B3) Rabbit mAb (#9323), mTOR (7C10) (#2983S), AKT (#9272), GSK-3(3 (27C10) Rabbit mAb (#9315), SMG-1 (Q25) Rabbit mAb (#4993s),此外,二抗也均購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。2.5數(shù)據(jù)分析和統(tǒng)計(jì)統(tǒng)計(jì)分析采用SPSS統(tǒng)計(jì)軟件(18.0版)和GraphPad Prism 5.0軟件。所有數(shù)據(jù)均表示為x+s,各個(gè)組之間的差別應(yīng)用t檢驗(yàn),以P0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。3結(jié)果3.1體外實(shí)驗(yàn)中AZD5363抑制肝癌細(xì)胞系的增殖呈時(shí)間和劑量依賴性給予不同濃度的AZD5363后,Hep-G2和Huh-7的細(xì)胞生長能力均受到明顯抑制,并且隨藥物濃度的升高,抑制率加大,兩種細(xì)胞的抑制曲線相似。加藥72h后,Hep-G2的IC50值約為18.476μmol/L,而Huh-7的IC50值約為17.80μmol/L,表明AZD5363能明顯作用于兩種細(xì)胞系,抑制細(xì)胞增殖,并且Huh 7細(xì)胞系對AZD5363更敏感。3.2 AZD5363抑制肝癌細(xì)胞的遷移能力AZD5363能明顯抑制Hep-G2和Huh-7細(xì)胞系的遷移能力,并且隨藥物劑量的加大,其抑制率明顯提高。3.3 AZD5363抑制AKT分子的磷酸化Western blot的結(jié)果顯示,AZD5363作用于Hep-G2和Huh-7兩種細(xì)胞系的AKT信號通路,能明顯抑制AKT及GSK-3β分子的磷酸化,并呈明顯的劑量依賴性,兩種細(xì)胞系的結(jié)果相似。3.4 AZD5363能促進(jìn)Huh-7細(xì)胞系mTOR分子的磷酸化Hep-G2和Huh-7同時(shí)暴露于AZD5363不同的時(shí)間后,Huh-7細(xì)胞系的磷酸化的mTOR分子表達(dá)增強(qiáng),統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示,Huh-7的AZD5363組的表達(dá)水平高于對照組,差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.01),而Hep-G2的表達(dá)水平差別無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。Hep-G2和Huh-7同時(shí)暴露于不同濃度的AZD5363后,同樣僅Huh-7的磷酸化的mTOR水平的改變有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.01)。同時(shí),從mTOR分子磷酸化水平的改變趨勢可以看出,其改變呈現(xiàn)一定的時(shí)間和計(jì)量依賴性,即隨作用時(shí)間延長和劑量加大,磷酸化的mTOR分子改變水平也增高。3.5 AZD5363能促進(jìn)Huh-7細(xì)胞系SMG-1分子的表達(dá)Hep-G2和Huh-7同時(shí)暴露于AZD5363不同的時(shí)間后,Huh-7細(xì)胞系的SMG-1分子表達(dá)增強(qiáng),統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示,Huh-7的AZD5363組的表達(dá)水平高于對照組,差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.005),而Hep-G2的表達(dá)水平差別無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。Hep-G2和Huh-7同時(shí)暴露于不同濃度的AZD5363后,同樣僅Huh-7的SMG-1分子表達(dá)水平的改變有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.01)。同時(shí),從SMG-1分子表達(dá)水平的改變趨勢可以看出,其呈現(xiàn)一定的時(shí)間和計(jì)量依賴性,即隨作用時(shí)間延長和劑量加大,SMG-1分子改變水平也增高。4結(jié)論(1)AKT信號通路抑制劑AZD5363能明顯抑制肝癌細(xì)胞細(xì)胞增殖能力及細(xì)胞侵襲遷移的能力,并呈時(shí)間和劑量依賴性。(2)AZD5363能明顯抑制肝癌細(xì)胞AKT信號通路的表達(dá)水平,并呈時(shí)間和劑量依賴性。(3) AZD5363能明顯抑制肝癌細(xì)胞的mTOR蛋白分子和SMG-1蛋白分子的表達(dá)水平并呈時(shí)間和劑量依賴性,但其作用因肝癌細(xì)胞系的不同而不同。1研究目的(1)觀察高脂飲食對小鼠肝大部切除術(shù)后肝臟再生的影響。(2)探討高脂飲食對小鼠肝臟再生組織中Wip1蛋白表達(dá)及NF-KB信號通路的影響。2實(shí)驗(yàn)方法2.1動(dòng)物模型的建立及分組將48只8周齡雄性C57BL6小鼠隨機(jī)分為兩組：普通飲食組(n=24)和高脂飲食組(n=24)。所有小鼠均進(jìn)行2／3肝大部切除術(shù),術(shù)后給予相應(yīng)地飲食,其中普通飲食組的飼料脂肪含量約為6.5%,高脂飲食組的飼料脂肪含量約為21%。而后分別于術(shù)后48h、72h、120h再次手術(shù)切除小鼠的肝臟并取血,每組每個(gè)時(shí)間點(diǎn)8只小鼠,每只小鼠的肝組織分兩份,一份液氮凍存,一份福爾馬林中保存。2.2 Western blot取液氮中的小鼠再生肝組織,提取蛋白,檢測肝組織中增殖細(xì)胞核抗原(PCNA)、Wip1、cyclin D以及NF-KB信號通路的表達(dá)情況。2.3 RT-PCR取液氮中的小鼠再生肝組織,提取mRNA,檢測PCNA和Wip1的mRNA水平。3結(jié)果3.1肝大部切除術(shù)后肝重的變化統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)顯示小鼠行2/3肝臟切除術(shù)后,和對照組相比,高脂飲食組的肝重/體重質(zhì)量比在48h(3.05±0.20vs2.31±0.16)和72h(3.72±0.23vs3.02±0.19)明顯升高(p0.001)。 高脂飲食組的肝臟再生比率在48h(67.25±6.73vs51.50±4.78)和72h(78.98±4.77vs69。00±5.17)也相應(yīng)升高(p0.01)。3.2小鼠再生肝組織中增殖細(xì)胞核抗原(PCNA)的表達(dá)Western blot檢測結(jié)果顯示高脂飲食組術(shù)后24h和120h的PCNA蛋白的表達(dá)量均明顯高于對照組同一觀察點(diǎn)的PCNA蛋白表達(dá)量(P0.05),而術(shù)后72h的表達(dá)量差別無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,PCNA表達(dá)量的峰值在高脂飲食組出現(xiàn)在術(shù)后48h,而在對照組出現(xiàn)在術(shù)后72h。RT-PCR結(jié)果顯示術(shù)后實(shí)驗(yàn)組在48h的印值變化明顯高于相同時(shí)點(diǎn)對照組中的cp值變化(P0.002),第五天則差別不顯著。3.3小鼠再生肝組織p-NF-KB p65和cyclin D的表達(dá)：Western blot檢測結(jié)果顯示實(shí)驗(yàn)組術(shù)后48h,NF-KB及p-NF-KB的表達(dá)量明顯高于對照組同一觀察點(diǎn)的水平。實(shí)驗(yàn)組術(shù)后48h和72h的cyclin D的表達(dá)量也高于相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)對照組的表達(dá)量。3.4小鼠再生肝組織中Wip1的表達(dá)：Western blot檢測結(jié)果顯示實(shí)驗(yàn)組術(shù)后48h和120h wip1的表達(dá)量均明顯低于對照組同一觀察點(diǎn)的表達(dá)量(P0.001)。RT-PCR結(jié)果顯示術(shù)后實(shí)驗(yàn)組在48h的印值變化明顯低于相同時(shí)點(diǎn)對照組中的cp值變化(P0.05),其他時(shí)間點(diǎn)則差別不顯著。4結(jié)論(1)高脂飲食能促進(jìn)PCNA的表達(dá),促進(jìn)小鼠肝臟再生。(2)高脂飲食能促進(jìn)Wipl的表達(dá),促進(jìn)NF-KB信號通路的激活及其下游分子cyclin D的表達(dá)。本文揭示了高脂飲食在小鼠肝臟再生中作用并對其機(jī)制進(jìn)行初步探討,具有重要的學(xué)術(shù)意義。
【關(guān)鍵詞】：AZD5363 肝癌 AKT mTOR SMG-1 肝臟再生 高脂飲食 NF-KB wip1 小鼠
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R735.7
【目錄】：

• 論文Ⅰ AZD5363對肝癌細(xì)胞的作用及其機(jī)制研究6-40
• 中文摘要6-9
• 英文摘要9-14
• 符號說明14-15
• 1.前言15-16
• 2.材料與方法16-24
• 3.結(jié)果24-25
• 4.討論25-28
• 創(chuàng)新點(diǎn)和限制性28
• 結(jié)論28-29
• 附圖29-36
• 參考文獻(xiàn)36-40
• 論文Ⅱ 高脂飲食對肝大部切除術(shù)后肝臟再生的影響及其機(jī)制研究40-67
• 中文摘要40-42
• 英文摘要42-45
• 符號說明45-47
• 1.前言47-48
• 2.材料與方法48-54
• 3.結(jié)果54-55
• 4.討論55-57
• 創(chuàng)新點(diǎn)和限制性57
• 結(jié)論57-58
• 附表58-59
• 附圖59-63
• 參考文獻(xiàn)63-67
• 致謝67-68
• 攻讀碩士期間發(fā)表論文68-69
• 學(xué)位論文評閱及答辯情況表69

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本文編號：933204