本文關(guān)鍵詞：小白菊內(nèi)酯與三氧化二砷聯(lián)合誘導肝癌HepG2細胞及其腫瘤干細胞凋亡的研究

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【摘要】：背景：肝癌(liver cancer)對化療藥物的低敏感性或不敏感性是阻礙臨床治療效果的主要因素,而肝癌干細胞(liver cancer stem cells, LCSCs)是肝癌發(fā)生、發(fā)展、耐藥、轉(zhuǎn)移和復發(fā)的根源。因此,探尋治療肝癌或有效清除LCSCs的藥物或措施是當前研究的熱點。三氧化二砷(arsenic trioxide, ATO或As203)可通過抑制細胞增殖、誘導細胞凋亡、抑制腫瘤新生血管形成等發(fā)揮抗腫瘤作用,且具有殺傷腫瘤干細胞(cancer stem cells, CSCs)的效應(yīng),在白血病和實體腫瘤的臨床治療中取得了良好的療效。然而,ATO對實體腫瘤的治療效果較白血病為差,且所需劑量較高常產(chǎn)生較大的毒副作用,使ATO在實體腫瘤的臨床應(yīng)用受到較大限制。因此,探尋ATO與其它藥物的聯(lián)合使用,降低ATO的毒副作用,增加腫瘤細胞對ATO的敏感性是提高ATO臨床療效的有效措施之一。小白菊內(nèi)酯(Parthenolide, PTL)具有較強的抗腫瘤和抗CSCs活性以及對其它抗癌藥物增敏效應(yīng)。故探索PTL和ATO聯(lián)用抗肝癌細胞及其清除LCSCs的作用具有重要的實用價值。目的：研究PTL和ATO聯(lián)合對肝癌HepG2細胞的增殖抑制和誘導凋亡作用以及對LCSCs的殺傷效應(yīng),并探討其作用的分子機制。方法：采用MTT法檢測細胞增殖活性；瑞氏-吉姆薩染色、光學顯微鏡觀察細胞形態(tài)；電子顯微鏡觀察細胞超微結(jié)構(gòu)；集落形成法觀察細胞自我更新能力；AnnexinV/PI雙染檢測細胞凋亡；流式細胞術(shù)檢測細胞周期、凋亡相關(guān)蛋白Bax和Bcl-2表達、Caspase-3活性、細胞活性氧、線粒體膜電位以及細胞群體中LCSCs含量；流式細胞術(shù)結(jié)合干細胞免疫學標記CD 133+分選LCSCs;免疫印跡(Western Blotting)檢測凋亡相關(guān)蛋白P53/p-P53、Bcl-2和NF-κB的表達；實時熒光定量RT-PCR檢測bax、bcl-2、caspase-3、p53、nf-κb基因的表達水平。結(jié)果：1.肝癌HepG2細胞經(jīng)不同濃度的PTL和ATO處理24h、48h和72h,二者均呈濃度、時間依賴性地抑制HepG2細胞的增殖,ATO的半數(shù)抑制濃度(IC50)分別為22.7μM、18.2μM和6.6μM; PTL為25.3μM、16.6pM和8.3μM。PTL與ATO聯(lián)合應(yīng)用,對HepG2細胞的增殖抑制作用較PTL和ATO單用顯著增強。HepG2細胞集落形成實驗獲得類似的結(jié)果。提示：PTL與ATO聯(lián)合可協(xié)同性地增強HepG2細胞對ATO的敏感性。2.PTL和ATO單獨或聯(lián)合誘導HepG2細胞后,細胞呈現(xiàn)體積縮��；細胞質(zhì)致密；細胞核固縮、碎裂；染色質(zhì)濃集或邊集等典型凋亡形態(tài)學改變。細胞周期分布阻滯在G2/M期；Annexin V/PI染色顯示：PTL和ATO聯(lián)合作用后細胞凋亡率明顯高于PTL和ATO單獨作用,ATO或PTL單獨作用時以早期凋亡為主,而聯(lián)合作用則以晚期凋亡為主。實驗結(jié)果證實：ATO與PTL聯(lián)合的協(xié)同作用機制主要為誘導HepG2細胞的凋亡,PTL可增強肝癌HepG2細胞對ATO誘導凋亡的敏感性。3.ATO與PTL單獨或聯(lián)合作用后,HepG2細胞線粒體膜電位降低,bax基因mRNA及蛋白表達增高、bcl-2基因表達降低,Bax/Bc1-2比值明顯增加；Caspase-3活性顯著增高。PTL與ATO聯(lián)合作用效應(yīng)高于PTL或ATO單獨作用。提示：ATO與PTL聯(lián)合主要通過線粒體凋亡途徑激活Caspase-3進而誘導HepG2細胞凋亡。4.經(jīng)ATO和PTL單獨或聯(lián)合作用后,HepG2細胞P53的表達和磷酸化水平顯著增強；細胞活性氧含量升高,NF-κB的表達顯著受抑,ATO與PTL聯(lián)合作用的效果遠高于兩藥單獨應(yīng)用。推測P53可能通過增強Bax表達、抑制Bcl-2表達,促進線粒體膜去極化、釋放凋亡因子等參與調(diào)節(jié)線粒體途徑的細胞凋亡,而NF-κB不但能直接促進細胞的異常增殖,而且能抑制P53依賴的細胞的存活。據(jù)此提示：P53途徑與NF-κB途徑是ATO和PTL聯(lián)合誘導肝癌HepG2細胞凋亡的額外調(diào)控途徑。5.ATO和PTL單獨或聯(lián)合應(yīng)用具有對肝癌干細胞(LCSCs)的殺傷效應(yīng),無論是在HepG2細胞群體中的LCSCs,還是分選純化出來的LCSCs, ATO與PTL聯(lián)合均對其具有協(xié)同性的殺傷效應(yīng),其作用機制可能為誘導LCSCs凋亡。結(jié)論：小白菊內(nèi)酯和三氧化二砷聯(lián)合協(xié)同性地抑制肝癌HepG2細胞增殖和誘導其凋亡,且可有效地殺傷肝癌干細胞；小白菊內(nèi)酯和三氧化二砷主要通過線粒體途徑、P53途徑和NF-κB途徑誘導肝癌HepG2細胞凋亡。
【關(guān)鍵詞】：三氧化二砷 小白菊內(nèi)酯 凋亡 肝癌 腫瘤干細胞
【學位授予單位】：蘭州大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R735.7
【目錄】：

• 中文摘要3-5
• Abstract5-9
• 綜述9-22
• 摘要9
• 1 三氧化二砷的抗腫瘤研究進展9-17
• 2 小白菊內(nèi)酯誘導腫瘤細胞凋亡機制的研究進展17-21
• 3 結(jié)束語21-22
• 引言22-25
• 材料與方法25-39
• 1 材料25-30
• 2 方法30-38
• 3 統(tǒng)計分析38-39
• 結(jié)果39-67
• 1 小白菊內(nèi)酯聯(lián)合三氧化二砷抑制HepG2細胞的增殖活性39-44
• 2 小白菊內(nèi)酯聯(lián)合三氧化二砷誘導肝癌HepG2細胞的凋亡44-50
• 3 小白菊內(nèi)酯聯(lián)合三氧化二砷誘導肝癌HepG2細胞凋亡的分子機制50-62
• 4 小白菊內(nèi)酯聯(lián)合三氧化二砷誘導肝癌腫瘤干細胞凋亡62-67
• 討論67-70
• 結(jié)論70-71
• 參考文獻71-80
• 中英文縮略詞表80-82
• 致謝82

【參考文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前2條

1 王績英;趙雪強;王昌明;莫碧文;蔣明;陳峰;;三氧化二砷通過抑制NF-κB增強TRAIL誘導A549細胞凋亡的作用研究[J];四川大學學報(醫(yī)學版);2012年06期

2 唐俊;吳偉忠;;腫瘤干細胞與腫瘤轉(zhuǎn)移[J];中國臨床醫(yī)學;2013年04期

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本文編號：933418