本文關(guān)鍵詞：ATRX-C抗體的制備及在HPV16陽性宮頸癌組織中的初步應(yīng)用

  更多相關(guān)文章： ATRX 抗體 人乳頭瘤病毒16型(HPV16) 宮頸癌 定位

【摘要】：[目的]研制和初步評(píng)價(jià)ATRX-C抗體;分析ATRX蛋白在THP-1細(xì)胞中的定位及ATRX在人乳頭瘤病毒16型(HPV16)陽性宮頸癌組織中的表達(dá)和定位,為深入探討ATRX蛋白在HPV16所致宮頸癌中的作用及機(jī)制奠定基礎(chǔ)。[方法]設(shè)計(jì)ATRX C端基因片段(2193-2492氨基酸)引物,利用PCR擴(kuò)增目的片段,雙酶切后連接表達(dá)載體p ET30a,經(jīng)PCR、酶切、測(cè)序分析,構(gòu)建原核表達(dá)載體p ET30a/ATRX-C2193-2492;將質(zhì)粒p ET30a/ATRX-C2193-2492轉(zhuǎn)化E.coli BL21,IPTG誘導(dǎo)表達(dá),利用鎳離子親和層析法純化6His-ATRX-C2193-2492蛋白,利用Western blot檢測(cè)純化產(chǎn)物6His-ATRX-C2193-2492;將純化后的6His-ATRX-C2193-2492蛋白以皮下多點(diǎn)注射和腹腔注射方式免疫接種6只8周齡雌性BALB/c小鼠。初次免疫3周后,再免疫1次;第4、5周后分別再加強(qiáng)1次,共免疫接種4次。每次免疫前及末次免疫后7天取血,ELISA測(cè)定抗體效價(jià)。飽和硫酸銨鹽析沉淀法初步純化抗血清,并用Western blot檢測(cè)之;利用間接免疫熒光檢測(cè)Daxx和ATRX在THP-1細(xì)胞株中的分布與定位;收集正常宮頸組織細(xì)胞、HPV16陽性的宮頸上皮內(nèi)瘤變(CIN)、原位癌和浸潤(rùn)型宮頸癌組織標(biāo)本,通過免疫組化技術(shù)檢測(cè)宮頸組織中ATRX的分布和定位以及表達(dá)量;利用Western blot檢測(cè)正常宮頸組織,HPV16陽性的宮頸上皮內(nèi)瘤變(CIN)、原位癌和浸潤(rùn)型宮頸癌組織細(xì)胞中ATRX的表達(dá)量。[結(jié)果]經(jīng)PCR、雙酶切和測(cè)序鑒定,成功構(gòu)建p ET30a/ATRX-C2193-2492原核表達(dá)載體;表達(dá)載體p ET30a/ATRX-C2193-2492在E.coli中誘導(dǎo)表達(dá)分子量約34k Da產(chǎn)物,且該產(chǎn)物能與ATRX抗體發(fā)生反應(yīng),并且純化得到目的產(chǎn)物;利用純化后的6His-ATRX-C2193-2492蛋白免疫小鼠,制備的抗ATRX-C2193-2492多克隆抗體,其效價(jià)為1:12800;在THP-1細(xì)胞中,ATRX顯綠色信號(hào)和Daxx顯紅色信號(hào),兩種信號(hào)都定位于細(xì)胞核,融合時(shí)出現(xiàn)黃色信號(hào);ATRX在正常宮頸組織細(xì)胞具有較高表達(dá)并主要定位在細(xì)胞核;在HPV16陽性的宮頸上皮內(nèi)瘤變(CIN)組織細(xì)胞的表達(dá)與正常細(xì)胞類似;在原位癌組織細(xì)胞中表達(dá)量姣CIN中減低,主要定位在細(xì)胞核和細(xì)胞漿;在浸潤(rùn)型宮頸癌組織細(xì)胞中表達(dá)量降低,主要定位在細(xì)胞漿,細(xì)胞核中表達(dá)量明顯減少。[結(jié)論]制備的ATRX-C2193-2492抗血清可用于檢測(cè)組織和細(xì)胞中的ATRX蛋白;ATRX蛋白在THP-1細(xì)胞核和正常宮頸組織細(xì)胞中大量表達(dá);在HPV16陽性所致的宮頸癌進(jìn)程中,其表達(dá)量可能逐漸減少。
【關(guān)鍵詞】：ATRX 抗體 人乳頭瘤病毒16型(HPV16) 宮頸癌 定位
【學(xué)位授予單位】：南華大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R737.33
【目錄】：

• 摘要4-6
• Abstract6-9
• 主要英文縮略語索引9-13
• 第1章 緒論13-15
• 第2章 材料與試劑15-19
• 2.1 主要實(shí)驗(yàn)儀器15-16
• 2.2 菌種、質(zhì)粒和細(xì)胞株16
• 2.3 主要實(shí)驗(yàn)試劑16-19
• 第3章 實(shí)驗(yàn)方法19-31
• 3.1 ATRX-C_(2193-2492)片段的擴(kuò)增19-21
• 3.2 原核表達(dá)載體pET30a/ATRX-C_(2193-2492)的構(gòu)建21-23
• 3.3 6 His-ATRX-C_(2193-2492)蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)及其檢測(cè)23-26
• 3.4 6His-ATRX-C_(2193-2492)抗體的制備26-28
• 3.5 ATRX-C_(2193-2492)抗體的初步應(yīng)用28-29
• 3.6 宮頸組織中 ATRX 蛋白的表達(dá)29-31
• 第4章 實(shí)驗(yàn)結(jié)果31-39
• 4.1 PCR擴(kuò)增ATRX-C_(2193-2492)31
• 4.2 pET30a/ATRX-C_(2193-2492)載體PCR及雙酶切鑒定31-32
• 4.3 融合蛋白 6His-ATRX-C_(2193-2492)的誘導(dǎo)表達(dá)與純化及鑒定32-34
• 4.4 ATRX-C_(2193-2492)抗體的鑒定34-35
• 4.5 ATRX-C_(2193-2492)抗體的初步應(yīng)用35-37
• 4.6 ATRX蛋白在正常和異常宮頸組織中的表達(dá)37-39
• 第5章 討論39-43
• 第6章 結(jié)論43-45
• 參考文獻(xiàn)45-49
• 附件49-55
• 綜述55-64
• 參考文獻(xiàn)61-64
• 讀碩期間參與課題與論文64-65
• 本研究基金資助65-66
• 致謝66

【參考文獻(xiàn)】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前1條

1 ;HPV陽性的扁桃體癌和舌癌患者預(yù)后較好[J];藥學(xué)進(jìn)展;2008年07期

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本文編號(hào)：919279