本文關(guān)鍵詞：ATRX-C抗體的制備及在HPV16陽性宮頸癌組織中的初步應用

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【摘要】：[目的]研制和初步評價ATRX-C抗體;分析ATRX蛋白在THP-1細胞中的定位及ATRX在人乳頭瘤病毒16型(HPV16)陽性宮頸癌組織中的表達和定位,為深入探討ATRX蛋白在HPV16所致宮頸癌中的作用及機制奠定基礎(chǔ)。[方法]設(shè)計ATRX C端基因片段(2193-2492氨基酸)引物,利用PCR擴增目的片段,雙酶切后連接表達載體p ET30a,經(jīng)PCR、酶切、測序分析,構(gòu)建原核表達載體p ET30a/ATRX-C2193-2492;將質(zhì)粒p ET30a/ATRX-C2193-2492轉(zhuǎn)化E.coli BL21,IPTG誘導表達,利用鎳離子親和層析法純化6His-ATRX-C2193-2492蛋白,利用Western blot檢測純化產(chǎn)物6His-ATRX-C2193-2492;將純化后的6His-ATRX-C2193-2492蛋白以皮下多點注射和腹腔注射方式免疫接種6只8周齡雌性BALB/c小鼠。初次免疫3周后,再免疫1次;第4、5周后分別再加強1次,共免疫接種4次。每次免疫前及末次免疫后7天取血,ELISA測定抗體效價。飽和硫酸銨鹽析沉淀法初步純化抗血清,并用Western blot檢測之;利用間接免疫熒光檢測Daxx和ATRX在THP-1細胞株中的分布與定位;收集正常宮頸組織細胞、HPV16陽性的宮頸上皮內(nèi)瘤變(CIN)、原位癌和浸潤型宮頸癌組織標本,通過免疫組化技術(shù)檢測宮頸組織中ATRX的分布和定位以及表達量;利用Western blot檢測正常宮頸組織,HPV16陽性的宮頸上皮內(nèi)瘤變(CIN)、原位癌和浸潤型宮頸癌組織細胞中ATRX的表達量。[結(jié)果]經(jīng)PCR、雙酶切和測序鑒定,成功構(gòu)建p ET30a/ATRX-C2193-2492原核表達載體;表達載體p ET30a/ATRX-C2193-2492在E.coli中誘導表達分子量約34k Da產(chǎn)物,且該產(chǎn)物能與ATRX抗體發(fā)生反應,并且純化得到目的產(chǎn)物;利用純化后的6His-ATRX-C2193-2492蛋白免疫小鼠,制備的抗ATRX-C2193-2492多克隆抗體,其效價為1:12800;在THP-1細胞中,ATRX顯綠色信號和Daxx顯紅色信號,兩種信號都定位于細胞核,融合時出現(xiàn)黃色信號;ATRX在正常宮頸組織細胞具有較高表達并主要定位在細胞核;在HPV16陽性的宮頸上皮內(nèi)瘤變(CIN)組織細胞的表達與正常細胞類似;在原位癌組織細胞中表達量姣CIN中減低,主要定位在細胞核和細胞漿;在浸潤型宮頸癌組織細胞中表達量降低,主要定位在細胞漿,細胞核中表達量明顯減少。[結(jié)論]制備的ATRX-C2193-2492抗血清可用于檢測組織和細胞中的ATRX蛋白;ATRX蛋白在THP-1細胞核和正常宮頸組織細胞中大量表達;在HPV16陽性所致的宮頸癌進程中,其表達量可能逐漸減少。
【關(guān)鍵詞】：ATRX 抗體 人乳頭瘤病毒16型(HPV16) 宮頸癌 定位
【學位授予單位】：南華大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R737.33
【目錄】：

• 摘要4-6
• Abstract6-9
• 主要英文縮略語索引9-13
• 第1章 緒論13-15
• 第2章 材料與試劑15-19
• 2.1 主要實驗儀器15-16
• 2.2 菌種、質(zhì)粒和細胞株16
• 2.3 主要實驗試劑16-19
• 第3章 實驗方法19-31
• 3.1 ATRX-C_(2193-2492)片段的擴增19-21
• 3.2 原核表達載體pET30a/ATRX-C_(2193-2492)的構(gòu)建21-23
• 3.3 6 His-ATRX-C_(2193-2492)蛋白的誘導表達及其檢測23-26
• 3.4 6His-ATRX-C_(2193-2492)抗體的制備26-28
• 3.5 ATRX-C_(2193-2492)抗體的初步應用28-29
• 3.6 宮頸組織中 ATRX 蛋白的表達29-31
• 第4章 實驗結(jié)果31-39
• 4.1 PCR擴增ATRX-C_(2193-2492)31
• 4.2 pET30a/ATRX-C_(2193-2492)載體PCR及雙酶切鑒定31-32
• 4.3 融合蛋白 6His-ATRX-C_(2193-2492)的誘導表達與純化及鑒定32-34
• 4.4 ATRX-C_(2193-2492)抗體的鑒定34-35
• 4.5 ATRX-C_(2193-2492)抗體的初步應用35-37
• 4.6 ATRX蛋白在正常和異常宮頸組織中的表達37-39
• 第5章 討論39-43
• 第6章 結(jié)論43-45
• 參考文獻45-49
• 附件49-55
• 綜述55-64
• 參考文獻61-64
• 讀碩期間參與課題與論文64-65
• 本研究基金資助65-66
• 致謝66

【參考文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前1條

1 ;HPV陽性的扁桃體癌和舌癌患者預后較好[J];藥學進展;2008年07期

，

本文編號：919279