本文關(guān)鍵詞：miR-199a通過靶向調(diào)控DDR1的表達抑制小鼠乳腺癌細胞4T-1的轉(zhuǎn)移

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【摘要】：乳腺癌是女性高發(fā)腫瘤類型,緊隨肺癌之后,嚴重威脅女性健康。其發(fā)病機制十分復雜,但根本原因在于遺傳基因的改變,其中包括癌基因的過度活化和抑癌基因功能的抑制。乳腺癌的發(fā)生、生長、侵襲與轉(zhuǎn)移等發(fā)展階段都存在相應(yīng)的遺傳基因改變,都受到基因的調(diào)節(jié)。乳腺癌的主要致死原因在于其向腦部、肺部、肝臟及骨骼等部位的遠處轉(zhuǎn)移,因此研究乳腺癌的轉(zhuǎn)移機制對乳腺癌治療具有重要意義。當今,乳腺癌的臨床治療方法主要有:手術(shù)療法、化學藥物療法、內(nèi)分泌療法以及生物分子靶向療法。雖然化學藥物治療在一定程度上提高了乳腺癌患者的生存率,但是藥物抵抗的頻繁出現(xiàn)使得腫瘤治療困難重重。因此,生物分子靶向治療應(yīng)運而生,開啟了乳腺癌治療的新篇章。探索乳腺癌發(fā)生、生長、侵襲與轉(zhuǎn)移等發(fā)展階段的分子機制,尋找新的生物分子治療靶點成為研究乳腺癌的重中之重。mi R-199家族包括mi R-199-a1,mi R-199-a2和mi R-199b三個成員。mi R-199a有兩個成熟序列:mi R-199a-5p和mi R-199a-3p,分別位于人的19號染色體(mi R-199-a1)和1號染色體(mi R-199-a2)上。研究表明mi R-199a在腫瘤細胞中存在過量表達或者表達量下調(diào)現(xiàn)象,提示mi R-199a可以通過調(diào)控下游癌基因或者抑癌基因參與調(diào)控腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程。DDR(discoidin domain receptor)家族包括2個成員:DDR1和DDR2,DDR2只有一個亞型,DDR1則分為5個亞型(DDR1a-DDR1e)。DDR1a、DDR1b和DDR1c是具有活性的DDR1亞型,其中DDR1c是最長的DDR1亞型。DDR1d和DDR1e沒有激酶活性。DDR1在人和小鼠的很多組織中表達,尤其是腦部、肺部、腎臟和脾臟。研究表明DDR1通過調(diào)節(jié)腫瘤細胞與膠原的相互作用在腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮作用。DDR1在很多類型的腫瘤細胞中表達量上調(diào),如:乳腺癌、肺癌、腦癌、肝癌、淋巴瘤等。這一表達的失調(diào)和功能的改變與腫瘤的發(fā)展過程和腫瘤病人的預(yù)后不良密切相關(guān)。在本研究中,我們證實了mi R-199a和DDR1在乳腺癌轉(zhuǎn)移過程中的作用并驗證了mi R-199a通過靶向調(diào)控基因DDR1的表達發(fā)揮其生物學作用。實驗一過表達mi R-199a抑制小鼠乳腺癌細胞4T-1的轉(zhuǎn)移目的:觀察mi R-199a在乳腺癌轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮的作用。方法:構(gòu)建mi R-199a的表達質(zhì)粒pc DNA3.1-mi R-199a,利用重組質(zhì)粒建立穩(wěn)定過表達mi R-199a的4T-1-Luc小鼠乳腺癌細胞系,并通過QRT-PCR檢測技術(shù)進行驗證。在體外,運用TranswellTM實驗研究穩(wěn)定細胞系的遷移能力,分析mi R-199a對乳腺癌細胞遷移的作用;在體內(nèi),將穩(wěn)定細胞系通過尾靜脈注射入免疫力正常的BALB/c小鼠體內(nèi),利用熒光素酶活體成像實驗觀察mi R-199a對乳腺癌細胞體內(nèi)轉(zhuǎn)移的作用,通過小鼠肺組織的HE(hematoxylin and eosin)染色和免疫組化實驗做進一步驗證。結(jié)果:過表達mi R-199a的小鼠乳腺癌穩(wěn)定細胞系構(gòu)建成功;在體外,過表達mi R-199a抑制乳腺癌細胞的遷移;在體內(nèi),過表達mi R-199a抑制乳腺癌的肺轉(zhuǎn)移。結(jié)論:mi R-199a抑制小鼠乳腺癌的轉(zhuǎn)移。實驗二mi R-199a對DDR1的調(diào)控關(guān)系研究目的:證實DDR1是mi R-199a的下游靶向調(diào)控基因。方法:利用生物信息學網(wǎng)站分別預(yù)測人和鼠的mi R-199a對DDR1非翻譯區(qū)(3’UTR)的可能結(jié)合位點;克隆野生型DDR1 3’UTR序列以及每一個可能的結(jié)合位點突變后的突變型DDR1 3’UTR序列;利用熒光素酶報告基因?qū)嶒烌炞Cmi R-199a對DDR1的直接調(diào)控作用和靶向調(diào)控位點。結(jié)果:mi R-199a可以靶向下調(diào)野生型DDR1的表達;確定了mi R-199a調(diào)控DDR1的靶向結(jié)合位點。結(jié)論:DDR1是mi R-199a的下游靶基因。實驗三DDR1在乳腺癌轉(zhuǎn)移過程中的生物學作用目的:研究干涉DDR1的表達對乳腺癌轉(zhuǎn)移的作用。方法:構(gòu)建DDR1的干涉質(zhì)粒sh DDR1,并且包裝重組慢病毒。利用重組慢病毒建立干涉DDR1表達的4T-1-Luc小鼠乳腺癌穩(wěn)定細胞系,并通過QRT-PCR和Western Blot技術(shù)驗證細胞系內(nèi)DDR1的干涉情況。在體外,通過TranswellTM實驗研究穩(wěn)定細胞系的遷移能力,分析DDR1對乳腺癌細胞遷移的作用;在體內(nèi),將穩(wěn)定細胞系經(jīng)尾靜脈注射入免疫力正常的BALB/c小鼠體內(nèi),利用熒光素酶活體成像實驗分析DDR1對乳腺癌細胞體內(nèi)轉(zhuǎn)移的作用,通過小鼠肺組織的HE染色和免疫組化實驗做進一步驗證。結(jié)果:干涉DDR1表達的小鼠乳腺癌穩(wěn)定細胞系構(gòu)建成功;在體外,干涉DDR1的表達能夠抑制乳腺癌細胞的遷移;在體內(nèi),干涉DDR1的表達能夠抑制乳腺癌的肺轉(zhuǎn)移。結(jié)論:干涉DDR1的表達能夠抑制小鼠乳腺癌的轉(zhuǎn)移。實驗四mi R-199的臨床意義研究目的:研究mi R-199與乳腺癌臨床預(yù)后的相關(guān)性。方法:運用TCGA數(shù)據(jù)庫對大樣本病例進行統(tǒng)計分析,得到mi R-199與臨床乳腺癌患者預(yù)后的關(guān)系。結(jié)果:mi R-199表達量高的乳腺癌患者存活率高。結(jié)論:mi R-199表達量與乳腺癌臨床預(yù)后呈正相關(guān)。
【關(guān)鍵詞】：乳腺癌 轉(zhuǎn)移 miR-199a DDR1
【學位授予單位】：第四軍醫(yī)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R737.9
【目錄】：

• 縮略語表5-7
• 中文摘要7-10
• ABSTRACT10-14
• 前言14-16
• 文獻回顧16-31
• 實驗一 過表達MIR-199A抑制小鼠乳腺癌細胞 4T-1 的轉(zhuǎn)移31-42
• 引言31
• 1 材料31-32
• 2 方法32-36
• 3 結(jié)果36-40
• 4 討論40-42
• 實驗二 MIR-199A與DDR1調(diào)控關(guān)系的研究42-52
• 引言42
• 1 材料42-43
• 2 方法43-46
• 3 結(jié)果46-51
• 4 討論51-52
• 實驗三 干涉DDR1的表達抑制小鼠乳腺癌細胞 4T-1 的轉(zhuǎn)移52-64
• 引言52
• 1 材料52-53
• 2 方法53-56
• 3 結(jié)果56-62
• 4 討論62-64
• 實驗四 MIR-199與乳腺癌臨床預(yù)后相關(guān)性64-67
• 引言64
• 1 材料64
• 2 方法64-65
• 3 結(jié)果65-66
• 4 討論66-67
• 小結(jié)67-69
• 參考文獻69-87
• 個人簡歷和研究成果87-88
• 致謝88

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本文編號：917921