本文關(guān)鍵詞：胞質(zhì)NPM1突變蛋白穩(wěn)定丙酮酸激酶增強(qiáng)白血病細(xì)胞有氧糖酵解表型

  更多相關(guān)文章： NPM1 基因突變 PKM2 有氧糖酵解 急性髓系白血病

【摘要】：目的:腫瘤細(xì)胞的有氧糖酵解能夠促進(jìn)其惡性轉(zhuǎn)化,目前已知多種基因可參與調(diào)控該過(guò)程。核仁磷酸蛋白(nucleophosmin,NPM1)是急性髓系白血病(acute myeloid leukemia,AML)中最常見(jiàn)的基因突變,對(duì)AML的發(fā)生、治療以及預(yù)后有重要影響。然而,NPM1突變?cè)贏ML有氧糖酵解表型中的調(diào)控作用尚未闡明。本文探討NPM1突變對(duì)AML有氧糖酵解表型的影響及相關(guān)分子機(jī)制,進(jìn)一步觀察有氧糖酵解表型對(duì)NPM1突變AML細(xì)胞體外增殖能力的影響。方法:采用基因過(guò)表達(dá)的方法,在白血病細(xì)胞株THP-1中過(guò)表達(dá)NPM1 A型突變蛋白(NPM1-mA),觀察NPM1-mA對(duì)白血病細(xì)胞糖酵解表型的影響。采用慢病毒RNA干擾的方法,感染天然攜帶NPM1-mA的白血病細(xì)胞株OCI/AML3后,觀察干擾NPM1-mA對(duì)白血病細(xì)胞糖酵解表型的影響。qRT-PCR和Western blot方法檢測(cè)髓系白血病細(xì)胞株中NPM1-mA基因和蛋白的表達(dá)。Glucose Assay Kit和Lactate Assay Kit試劑盒檢測(cè)培養(yǎng)基中葡萄糖消耗量和乳酸生成量。利用2?,7?-Dichlorofluorescin Diacetate(DCF-DA)探針檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)活性氧(ROS)水平。在OCI/AML3細(xì)胞中,利用免疫共沉淀(IP)聯(lián)合質(zhì)譜檢測(cè)(MS)技術(shù)篩選出與NPM1-mA蛋白相互作用的糖酵解相關(guān)蛋白。通過(guò)內(nèi)源性co-ip實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證蛋白間的相互作用。免疫熒光實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證npm1-ma與糖酵解相關(guān)目的蛋白(pkm2)的亞細(xì)胞共定位。進(jìn)一步利用放線菌酮處理oci/aml3細(xì)胞,檢測(cè)pkm2的蛋白穩(wěn)定性變化。之后,采用rna干擾和過(guò)表達(dá)方法調(diào)控pkm2蛋白表達(dá),觀察npm1-ma白血病細(xì)胞糖酵解水平的改變。通過(guò)cck-8法和克隆形成實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步觀察pkm2對(duì)npm1-ma白血病細(xì)胞體外增殖能力的影響。結(jié)果:成功建立npm1-ma過(guò)表達(dá)的thp-1細(xì)胞株,npm1-ma組細(xì)胞糖酵解水平上升(p0.05),ros水平下調(diào)(p0.05);而干擾npm1-ma的oci/aml3細(xì)胞株中,sh-npm1組細(xì)胞糖酵解水平下降(p0.05),ros水平上調(diào)(p0.05)。ip聯(lián)合ms篩選出與npm1-ma蛋白相互作用的兩種糖酵解關(guān)鍵酶(pfkl和pkm2)。采用westernblot方法在6株白血病細(xì)胞株中檢測(cè)pfkl和pkm2蛋白表達(dá)水平,結(jié)果發(fā)現(xiàn)pkm2蛋白高表達(dá)而pfkl蛋白表達(dá)水平難以檢測(cè)。細(xì)胞內(nèi)co-ip實(shí)驗(yàn)證實(shí)了npm1-ma蛋白與pkm2蛋白的相互作用,且二者共定位于細(xì)胞質(zhì)中。過(guò)表達(dá)npm1-ma促進(jìn)pkm2蛋白水平,而干擾npm1-ma則下調(diào)pkm2蛋白水平,同時(shí)細(xì)胞內(nèi)pkm2蛋白的穩(wěn)定性下降。此外,干擾oci/aml3細(xì)胞株pkm2的表達(dá),結(jié)果發(fā)現(xiàn)sh-pkm2組細(xì)胞糖酵解水平下降(p0.05),ros水平上調(diào)(p0.05)。若在npm1-ma下調(diào)的oci/aml3細(xì)胞株中恢復(fù)pkm2的表達(dá),則發(fā)現(xiàn)白血病細(xì)胞的糖酵解水平上升(p0.05),ros水平下調(diào)(p0.05)。另外,sh-pkm2組細(xì)胞增殖能力和克隆形成能力明顯降低(p0.05),而恢復(fù)pkm2表達(dá)的flag-pkm2組細(xì)胞的細(xì)胞增殖能力和克隆形成能力明顯增強(qiáng)(p0.05)。結(jié)論:NPM1-mA參與調(diào)控白血病細(xì)胞的高糖酵解表型。移位至胞質(zhì)中的NPM1-mA蛋白可與糖酵解關(guān)鍵限速酶PKM2結(jié)合并穩(wěn)定PKM2蛋白分子。PKM2介導(dǎo)的高糖酵解水平增強(qiáng)了白血病細(xì)胞的體外增殖能力。靶向PKM2抑制糖酵解水平可能成為攜帶NPM1突變白血病臨床治療研究的一種新策略。
【關(guān)鍵詞】：NPM1 基因突變 PKM2 有氧糖酵解 急性髓系白血病
【學(xué)位授予單位】：重慶醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類(lèi)號(hào)】：R733.7
【目錄】：

• 英漢縮略語(yǔ)名詞對(duì)照4-6
• 中文摘要6-9
• 英文摘要9-12
• 前言12-15
• 第一部分 NPM1突變蛋白參與調(diào)控白血病細(xì)胞的有氧糖酵解15-31
• 1 材料與方法15-25
• 2 結(jié)果25-29
• 3 討論29-31
• 第二部分 NPM1突變蛋白穩(wěn)定糖酵解關(guān)鍵酶PKM231-44
• 1 材料與方法31-34
• 2 結(jié)果34-41
• 3 討論41-44
• 第三部分 PKM2介導(dǎo)的糖酵解在白血病細(xì)胞生長(zhǎng)中的作用44-53
• 1 材料與方法44-45
• 2 結(jié)果45-51
• 3 討論51-53
• 全文總結(jié)53-54
• 參考文獻(xiàn)54-58
• 文獻(xiàn)綜述58-67
• 參考文獻(xiàn)63-67
• 致謝67-68
• 攻讀碩士期間發(fā)表的文章及相關(guān)課題68-69

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本文編號(hào)：909793