本文關(guān)鍵詞：木香揮發(fā)油活性成分抗肝癌作用的研究

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【摘要】：【研究背景和目的】木香為菊科多年生草本木香Aucklandia lappa Decne的干燥根,其成分主要有揮發(fā)油、甾醇類、生物堿、有機(jī)酸等�；诨钚詫�(dǎo)向的分段篩選策略,我們發(fā)現(xiàn)木香揮發(fā)油(Volatile Oil from Saussurea lappa Decne,VOSL)是木香的抗癌活性成分,其中木香烴內(nèi)酯(Costunolide,Cos)和去氫木香內(nèi)酯(Dehydrocostus lactone,Dehy)是VOSL最主要的組成成分,這兩個活性成分的含量約占VOSL總含量的75%。國內(nèi)外眾多研究顯示,Cos和Dehy在抗炎、抗腫瘤、抗病毒、抑制血管收縮和免疫調(diào)節(jié)等方面都有非常好的藥理功效。更重要的是,我們前期還發(fā)現(xiàn),Cos和Dehy在體內(nèi)具有協(xié)同抗腫瘤的效果,VOSL給藥組與(Cos-Dehy)聯(lián)合給藥組對裸鼠MCF-7乳腺癌移植瘤均具有顯著的抑制作用,作用效果優(yōu)于Cos或Dehy單個化合物給藥。此外,VOSL不僅能抑制MCF-7移植瘤的生長,還能保持荷瘤裸鼠的體重和活力,這對于裸鼠的“荷瘤生存”具有重要意義。中藥治療癌癥盡管有著悠久的應(yīng)用歷史,但迄今并未成為癌癥治療的主流手段,究其原因,有一點非常重要,就是中藥的單方或復(fù)方化學(xué)成分非常復(fù)雜,這將會導(dǎo)致其活性成分不清楚,藥理機(jī)制不明確,質(zhì)控和現(xiàn)代工業(yè)化生產(chǎn)困難,因此很難被現(xiàn)代的醫(yī)藥體系(尤其是西方國家)所接受。中藥現(xiàn)代化,就是要盡量保持中藥“多成分、多靶點、系統(tǒng)治療”特點的同時,朝著活性成分清楚、藥理機(jī)制明確、質(zhì)量可控的方向努力。某種程度上說,中藥木香因其化學(xué)成分復(fù)雜,就像一個“黑箱”,而VOSL的化學(xué)成分則要簡單得多,其主要成份即為Cos和Dehy,因此VOSL如同一個“灰箱”,Cos和Dehy是化學(xué)結(jié)構(gòu)明確的單個化合物,其藥理機(jī)制的研究相對清晰,如同一個“白箱”。本項目以VOSL治療肝癌為研究對象,采用從“白箱→灰箱→黑箱”逐級遞進(jìn)的研究思路,來評價VOSL抗肝癌的藥效并探索其作用機(jī)制,為“多成分、多靶點、低毒性”的新型抗癌藥VOSL注射液的開發(fā)提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。同時,通過本項目,我們希望能闡明中藥木香的抗癌作用機(jī)制,為我國的中藥現(xiàn)代化戰(zhàn)略做出一點貢獻(xiàn)�！狙芯糠椒ā�1.篩選敏感細(xì)胞系:通過細(xì)胞增殖實驗MTT方法篩選出對木香揮發(fā)油VOSL及其有效活性成分敏感性較強(qiáng)的細(xì)胞系。在SMMC-7721、Hep3B、Hep G2、Huh-7、HCC-LM3、L02、WRL-68細(xì)胞系中,選定SMMC-7721和Hep3B細(xì)胞系進(jìn)行細(xì)胞學(xué)實驗。2.細(xì)胞克隆與細(xì)胞周期:將SMMC-7721和Hep3B細(xì)胞經(jīng)過Cos、Dehy、C+2D(Cos+2Dehy)及VOSL處理48h后,采用細(xì)胞克隆及流式細(xì)胞術(shù)研究各測試組對肝癌細(xì)胞克隆形成及細(xì)胞周期分布的影響。3.細(xì)胞凋亡:將上述細(xì)胞經(jīng)過Cos、Dehy、C+2D及VOSL處理48h后,采用Hoechst 33342和流式細(xì)胞術(shù)實驗,從定性和定量上檢測各測試組對肝癌細(xì)胞凋亡的影響。4.細(xì)胞遷移與侵襲:將上述細(xì)胞經(jīng)過Cos、Dehy、C+2D及VOSL處理48h后,采用細(xì)胞劃痕和Transwell侵襲實驗檢測各測試組對肝癌細(xì)胞遷移侵襲能力的影響。5.細(xì)胞蛋白表達(dá)的變化:收集各測試組處理48h后的細(xì)胞,提取總蛋白,通過Western blot實驗方法檢測與凋亡和侵襲相關(guān)的蛋白因子表達(dá)的變化。6.動物模型的建立:選擇較為敏感的肝癌細(xì)胞SMMC-7721建立裸鼠皮下移植瘤模型,給予Cos、Dehy、C+2D、VOSL及5-Fu進(jìn)行治療,觀察各治療組對腫瘤的生長和荷瘤裸鼠的影響,治療結(jié)束后,取移植瘤標(biāo)本,制備石蠟切片,通過免疫組化實驗方法檢測相關(guān)蛋白表達(dá)的變化�！狙芯拷Y(jié)果】(一)木香揮發(fā)油VOSL對肝癌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響1.VOSL、Cos和Dehy對SMMC-7721、Hep3B、Hep G2、Huh-7等肝癌細(xì)胞的增殖都具有一定的抑制作用,其中SMMC-7721和Hep3B(VOSL作用的IC50分別為6.202±0.337、5.405±0.210μg/ml)最為敏感,而對正常肝細(xì)胞WRL-68和L02抑制能力最弱。2.肝癌細(xì)胞SMMC-7721和Hep3B經(jīng)過VOSL、Cos、Dehy、C+2D處理48h后繼續(xù)培養(yǎng)14天,與對照組相比可明顯觀察到各測試組對兩種肝癌細(xì)胞的克隆形成均有抑制作用。3.各測試組對兩種肝癌細(xì)胞的周期分布都有明顯的影響,在SMMC-7721細(xì)胞中,S期劑量依賴性增加,伴隨G0/G1和G2/M期的減少;同時在Hep3B細(xì)胞中,經(jīng)過Cos處理也表現(xiàn)出相似的結(jié)果,而經(jīng)過VOSL、Dehy、C+2D處理后,除了S期增加,G2/M也相應(yīng)地增加,伴隨G0/G1的減少。4.Hoechst 33342結(jié)果顯示,SMMC-7721和Hep3B兩種細(xì)胞系經(jīng)過VOSL、Cos、Dehy、C+2D分別處理后,細(xì)胞核激發(fā)的熒光強(qiáng)度與對照組相比明顯增強(qiáng),同時可觀察到細(xì)胞核固縮,呈現(xiàn)出典型的月牙狀,從形態(tài)上表明各組化合物均有誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡的作用。5.流式細(xì)胞術(shù)從定量上分析了各測試組對肝癌細(xì)胞凋亡的影響,結(jié)果顯示,隨著濃度的增加,SMMC-7721和Hep3B細(xì)胞的凋亡率依次上升,明顯高于對照組(3.46±0.69)%和(8.66±1.74)%,當(dāng)濃度達(dá)到IC50時,各測試組凋亡率均達(dá)到50%以上,成劑量依賴性,且主要表現(xiàn)在早期凋亡。6.各測試組以低濃度處理SMMC-7721和Hep3B細(xì)胞,通過劃痕實驗可明顯觀察到VOSL、Cos、Dehy、C+2D對肝癌細(xì)胞遷移的抑制作用。7.Transwell侵襲實驗證實,各測試組均有抑制肝癌細(xì)胞侵襲的能力。(二)木香揮發(fā)油VOSL對細(xì)胞凋亡及侵襲相關(guān)蛋白表達(dá)的影響1.Western blot檢測各測試組凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的變化,結(jié)果顯示,VOSL、Dehy、C+2D處理后,SMMC-7721和Hep3B細(xì)胞cleaved-Caspase3的表達(dá)有明顯上調(diào)的趨勢,同時Caspase3的表達(dá)明顯下調(diào),且呈劑量依賴性;經(jīng)過Cos處理后,在兩種細(xì)胞中cleaved-Caspase3和Caspase3蛋白表達(dá)沒有明顯的變化。結(jié)果表明Cos對誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡的機(jī)制可能與VOSL、Dehy、C+2D有所不同。2.Western blot檢測侵襲相關(guān)蛋白MMP-9的表達(dá),與對照組相比,經(jīng)過處理后SMMC-7721和Hep3B細(xì)胞中MMP-9表達(dá)均明顯下調(diào)。3.經(jīng)VOSL、Cos、Dehy和C+2D分別處理后,在SMMC-7721和Hep3B細(xì)胞中MMP-9的上游信號蛋白P38的磷酸化水平明顯下調(diào),而p-ERK的表達(dá)水平?jīng)]有明顯的變化;同時在VOSL、Dehy、C+2D測試組發(fā)現(xiàn)Akt的磷酸化水平也表現(xiàn)出下調(diào)的趨勢。4.經(jīng)VOSL、Cos、Dehy和C+2D分別處理后,發(fā)現(xiàn)P38和Akt的上游信號蛋白EGFR的磷酸化水平受到明顯的抑制,推定VOSL通過抑制EGFR信號通路,抑制了肝癌的發(fā)展。(三)木香揮發(fā)油VOSL對SMMC-7721裸鼠移植瘤的療效研究1.肝癌SMMC-7721細(xì)胞裸鼠移植瘤成瘤后,經(jīng)過Cos、Dehy、C+2D、VOSL及5-Fu以15mg/kg/天的量腹腔注射治療后24天,可觀察到各治療組移植瘤生長速度明顯低于NT對照組,其抑瘤率分別為23.15%、30.23%、37.51%、55.71%和42.22%,發(fā)現(xiàn)VOSL治療組的抑制作用最為明顯。2.TUNEL法標(biāo)記各治療組移植瘤組織中的凋亡細(xì)胞,結(jié)果顯示VOSL、Cos、Dehy及C+2D各治療組的凋亡陽性細(xì)胞數(shù)較NT對照組多,且VOSL治療組陽性細(xì)胞最多,這與VOSL治療荷瘤裸鼠的效果相一致。3.免疫組化檢測移植瘤組織中Ki67、p-P38、p-Akt和p-EGFR的變化,發(fā)現(xiàn)與對照組相比,各治療組Ki67、p-P38、p-Akt和p-EGFR的表達(dá)明顯降低,且VOSL治療組表達(dá)最少,推論VOSL是通過抑制EGFR信號通路,抑制了肝癌的發(fā)展�！狙芯拷Y(jié)論】本課題在細(xì)胞學(xué)以及動物水平上研究木香揮發(fā)油VOSL以及它的主要活性成分對肝細(xì)胞癌的作用及其機(jī)制。實驗結(jié)果表明,VOSL、Cos、Dehy和C+2D在體外均具有明顯的抑制肝癌細(xì)胞的增殖及誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡的活性作用,在低濃度條件下,可抑制肝癌細(xì)胞遷移與侵襲。VOSL以及它的主要活性成分能夠引起肝癌細(xì)胞SMMC-7721和Hep3B內(nèi)p-EGFR水平的下降,導(dǎo)致下游與侵襲、凋亡密切相關(guān)信號通路的蛋白P38和Akt磷酸化水平的下降,從而削弱肝癌侵襲與轉(zhuǎn)移的能力、誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞的凋亡。通過皮下成瘤實驗驗證VOSL抗腫瘤活性,證實VOSL可以延緩模型腫瘤的生長速度,且VOSL的抑瘤效果較C+2D好,說明VOSL內(nèi)可能存在另外的物質(zhì)在體內(nèi)對肝癌移植瘤有抑制作用,而這種猜測還有待進(jìn)一步的研究。
【關(guān)鍵詞】：木香揮發(fā)油VOSL 肝細(xì)胞癌 EGFR信號通路 移植瘤模型
【學(xué)位授予單位】：第二軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R735.7
【目錄】：

• 中文摘要6-10
• Abstract10-15
• 縮略詞表15-17
• 前言17-19
• 第一部分 木香揮發(fā)油對肝癌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響19-38
• 一、材料和方法19-27
• 二、實驗結(jié)果27-36
• 三、討論36-38
• 第二部分 木香揮發(fā)油誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡及抑制侵襲的機(jī)制研究38-50
• 一、材料和方法38-44
• 二、實驗結(jié)果44-47
• 三、討論47-50
• 第三部分 木香揮發(fā)油對肝癌細(xì)胞裸鼠移植瘤的療效研究50-60
• 一、材料與方法50-54
• 二、實驗結(jié)果54-57
• 三、討論57-60
• 全文小結(jié)60-61
• 參考文獻(xiàn)61-67
• 綜述 木香烴內(nèi)酯和去氫木香內(nèi)酯抗腫瘤作用機(jī)制 的研究進(jìn)展67-82
• 參考文獻(xiàn)75-82
• 碩士期間發(fā)表論文82-83
• 本課題所獲得的基金資助83-84
• 致謝84

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2 黃林芳;矢倉_，

本文編號：909673