本文關(guān)鍵詞：GSH2基因沉默對胰腺癌SW1990細胞的作用

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【摘要】：胰腺癌是致死率最高的腫瘤之一,五年生存率小于5%[1,2]。美國在過去的5年內(nèi),因胰腺癌每年死亡的人數(shù)超過30000人[3,4]。傳統(tǒng)治療手段包括手術(shù)、放療[5]、化療[6]等,療效均有限[7-10]。胰腺癌的早期預(yù)防、診斷、治療十分重要,亟待對其發(fā)病及進展原因的分子生物學(xué)基礎(chǔ)進行深入研究[11]。GS homeobox 2(GSH2)基因,同時也稱作GSX2基因,是同源盒基因家族的一員,定位于染色體4q12,由304個氨基酸組成[12]。GSH2基因是同源盒基因家族的一員,調(diào)控細胞的增殖、分化、凋亡、遷移、侵襲等功能。在胚胎神經(jīng)發(fā)育及神經(jīng)膠質(zhì)瘤形成中[13],GSH2協(xié)同SHH信號通路參與上述過程說明兩者聯(lián)系密切相關(guān),SHH通路在胰腺癌的發(fā)生發(fā)展中起重要作用[14-16],而GSH2在胰腺癌中的作用未見報道。本實驗檢測胰腺癌組織中GSH2基因的表達情況。通過RNA干擾技術(shù)[17]靶向沉默GSH2基因,檢測對胰腺癌SW1990細胞的增殖、遷移、侵襲等功能,吉西他濱敏感性[6]及HH信號通路通路關(guān)鍵分子SHH、GLI1的影響[14-16]。通過Co-IP[18-20]技術(shù)檢測在SW1990細胞中GSH2同SHH及GLI1的相互作用。第一部分GSH2基因在胰腺癌組織中的表達目的:檢測胰腺癌組織中GSH2基因的表達情況。材料與方法:收集胰腺癌組織及癌旁正常組織各3例,通過HE染色、免疫組織化學(xué)染色法檢測GSH2的表達情況。以癌旁正常組織為對照,用RT-PCR法檢測GSH2基因在m RNA水平表達的差異,蛋白印跡法檢測GSH2基因在蛋白水平表達的差異。結(jié)果:本部分實驗中免疫組化顯示GSH2在癌組織中表達明顯強于癌旁正常組織,主要表達在胰腺癌導(dǎo)管細胞的細胞核部位。RT-PCR結(jié)果顯示癌組織中GSH2的相對表達量:8.40±0.32,癌旁組織GSH2相對表達量:0.95±0.04,提示胰腺癌癌組織中GSH2的m RNA表達量較對照組高(t=23.27,p0.001)。蛋白印跡法結(jié)果提示胰腺癌癌組織中GSH2的蛋白表達量較對照組高。結(jié)論:GSH2基因在胰腺癌組織中高表達。第二部分沉默GSH2對胰腺癌SW1990細胞增殖、遷移、侵襲、吉西他濱敏感性及HH信號通路關(guān)鍵分子SHH、GLI1的影響目的:沉默GSH2對胰腺癌SW1990細胞增殖、遷移、侵襲、吉西他濱敏感性及HH信號通路關(guān)鍵分子SHH、GLI1的影響。材料與方法:用siRNA技術(shù)靶向沉默胰腺癌SW1990細胞的GSH2基因后,以轉(zhuǎn)染NC-siRNA的細胞做對照,檢測細胞增殖(CCK-8法)、遷移(Transwell法)、侵襲(Invasion Chamber法)能力變化。并聯(lián)合吉西他濱處理,檢測處理后細胞增殖及凋亡(流式細胞儀)的變化。構(gòu)建靶向沉默GSH2基因的sh RNA載體質(zhì)粒,并篩選沉默效果最佳者。用siRNA及sh RNA沉默GSH2基因,分別以轉(zhuǎn)染NC-siRNA及轉(zhuǎn)染空載質(zhì)粒的細胞做對照。通過RT-PCR[21]及蛋白印跡法檢測GSH2基因在m RNA及蛋白水平的沉默效率,并檢測HH信號通路關(guān)鍵分子SHH及GLI1在m RNA及蛋白水平的變化。結(jié)果:沉默GSH2基因后,細胞在450nm的吸光值為2.89±0.02,低于對照組(3.39±0.02;t=20.74,p0.001);遷移透膜細胞數(shù)為157.2±6.71,低于對照組(349.3±8.33;t=17.95,p0.001)侵襲透膜細胞數(shù)63.21±1.16,低于對照組(95.71±3.51;t=8.79,p0.001)。聯(lián)合吉西他濱處理后,細胞在450nm的吸光值為2.48±0.02,低于對照組(2.89±0.02;t=17.24,p0.001);細胞凋亡百分為39.70%±0.52%,高于對照組(26.38%±1.17%;t=10.39,p0.001)。成功構(gòu)建sh RNA重組質(zhì)粒并篩選出沉默效果最佳者。siRNA有效沉默GSH2后,RT-PCR檢測GLI1、SHH m RNA相對表達量分別為0.21±0.01、1.07±0.05,與對照組相比,Gli1 m RNA相對表達量顯著下調(diào)(1.00±0.05;t=16.69,p0.001)而SHH m RNA表達量變化無統(tǒng)計學(xué)差異(1.00±0.02;t=1.13,p=0.32);WB結(jié)果顯示Gli1蛋白表達明顯減少,而SHH蛋白表達無明顯改變。重組質(zhì)粒GSH2-sh RNA有效沉默GSH2后,RT-PCR檢測GLI1、SHH m RNA相對表達量分別為0.18±0.004、0.97±0.07,與對照組相比Gli1 m RNA相對表達量顯著下調(diào)(0.98±0.03;t=25.72,p0.001)而SHH m RNA表達量變化無統(tǒng)計學(xué)差異(1.00±0.02;t=0.42,p=0.70);WB結(jié)果顯示Gli1蛋白表達明顯減少,而SHH蛋白表達無明顯改變。結(jié)論:轉(zhuǎn)染GSH2-siRNA可降低胰腺癌SW1990細胞的增殖、遷移、侵襲能力,可增加對吉西他濱的敏感度。轉(zhuǎn)染GSH2-siRNA與GSH2-sh RNA均可減少HH信號通路關(guān)鍵分子GLI1的m RNA及蛋白水平的表達。第三部分胰腺癌SW1990細胞中GSH2與HH信號通路關(guān)鍵分子SHH及GLI1的聯(lián)系目的:檢測在胰腺癌SW1990細胞中GSH2與HH信號通路關(guān)鍵分子SHH及GLI1的聯(lián)系。材料與方法:獲取SW1990細胞的蛋白裂解液,采用Crosslink Magnetic Co-IP試劑盒,獲取SHH及GLI1的磁珠沉淀蛋白(pulldown蛋白),并以兔Ig G為陰性對照,無處理的蛋白裂解液為陽性對照。通過免疫印跡法檢測pulldown蛋白中GSH2的表達情況。結(jié)果:陽性對照中檢測出GSH2、SHH、GLI1蛋白。陰性對照未檢測到蛋白。SHH磁珠沉淀蛋白中檢測到SHH、GSH2蛋白。GLI1磁珠沉淀蛋白中檢測到GLI1、GSH2蛋白。結(jié)論:胰腺癌SW1990細胞中GSH2與SHH及GLI1存在蛋白間的相互作用。第四部分GSH2-siRNA裸鼠皮下瘤的體內(nèi)實驗?zāi)康?檢測GSH2-siRNA對胰腺癌SW1990細胞裸鼠皮下種植瘤增殖及吉西他濱敏感性的影響材料與方法:將siRNA處理48小時后的SW1990細胞種植于裸鼠右前肢背部皮下,每只接種1x107/100 ul細胞懸液,將裸鼠隨機分成A組:NC-siRNA;B組:GSH2-siRNA;C組:NC-siRNA+吉西他濱;D組:GSH2-siRNA+吉西他濱。兩周后開始腹腔注射吉西他濱(100mg/kg),每3天注射一次,連續(xù)腹腔注射2周后處死裸鼠,取出皮下瘤,記錄腫瘤體積,并觀察腹腔及胸腔轉(zhuǎn)移灶情況。結(jié)果:所有裸鼠在兩周后均可成瘤,處死后腹腔及胸腔均未見轉(zhuǎn)移灶。NC-siRNA組與GSH2-siRNA組的腫瘤體積無顯著差異(260.1±61.25、216.6±26.64,t=0.59,p=0.572)。聯(lián)合吉西他濱處理后,GSH2-siRNA組的腫瘤體積為74.4±16.19,小于NC-siRNA組(100.5±23.36,t=3.16,p=0.016)。結(jié)論:在裸鼠皮下瘤中,沉默GSH2基因可增加胰腺癌SW1990細胞對吉西他濱的敏感性。通過上述研究,本課題得出結(jié)論如下:1.GSH2基因在胰腺癌組織較癌旁正常組織中高表達。2.沉默GSH2基因可抑制胰腺癌細胞增殖、遷移、侵襲能力并提高對吉西他濱敏感性。3.胰腺癌SW1990細胞中GHS2、SHH、GLI1蛋白存在相互作用。
【關(guān)鍵詞】：胰腺癌 GSH2 HH信號通路 吉西他濱
【學(xué)位授予單位】：第二軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R735.9
【目錄】：

• 摘要5-9
• Abstract9-13
• 英文縮略詞表13-15
• 前言15-16
• 第一部分 GSH2基因在胰腺癌組織中的表達16-33
• 一、材料與方法16-28
• 二、結(jié)果28-31
• 三、討論31-33
• 第二部分 沉默GSH2對胰腺癌SW1990細胞增殖、遷移、侵襲、吉西他濱敏感性及HH信號通路關(guān)鍵分子SHH、GLI1的影響33-59
• 一、材料與方法34-49
• 二、結(jié)果49-57
• 三、討論57-59
• 第三部分 胰腺癌SW1990細胞中GSH2與HH信號通路關(guān)鍵分子SHH及GLI1的關(guān)系59-66
• 一、材料與方法59-62
• 二、結(jié)果62-64
• 三、討論64-66
• 第四部分 GSH2-siRNA裸鼠皮下瘤的體內(nèi)實驗66-70
• 一、材料與方法66-67
• 二、結(jié)果67-69
• 三、討論69-70
• 全文小結(jié)70-71
• 全文參考文獻71-79
• 在讀期間發(fā)表論文和參加科研情況79-80
• 致謝80

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本文編號：904707