本文關(guān)鍵詞：TNF-α促進(jìn)Th9細(xì)胞生成的作用和機(jī)制研究

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【摘要】：目的:免疫治療是近年來(lái)最具前景的腫瘤治療方法。在腫瘤免疫治療中,細(xì)胞免疫起著至關(guān)重要的作用�？鼓[瘤效應(yīng)T細(xì)胞包括CD4~+輔助性T細(xì)胞和CD8~+細(xì)胞毒性T細(xì)胞。Th9細(xì)胞是新近發(fā)現(xiàn)的一種Th細(xì)胞亞型,其主要特征是可分泌大量的IL-9。我們和其他研究團(tuán)隊(duì)最近發(fā)現(xiàn)Th9/IL-9在小鼠體內(nèi)具有很強(qiáng)的抗腫瘤活性,其對(duì)腫瘤的抑制效應(yīng)要優(yōu)于其他Th細(xì)胞。這表明,在腫瘤免疫治療中如何更有效的誘導(dǎo)和擴(kuò)增腫瘤特異性Th9細(xì)胞對(duì)提高腫瘤免疫療效具有重要意義。OX40/OX40L曾被認(rèn)為是唯一能促進(jìn)Th9細(xì)胞生成的TNF/TNF受體家族成員。然而,最近的研究表明TNF/TNF受體家族成員TL1A和GITR也能強(qiáng)有力的促進(jìn)Th9細(xì)胞的生成。這提示,TNF/TNF受體家族其他成員,如代表TNF家族原型的TNF-α,也可能有助于Th9細(xì)胞生成并促進(jìn)Th9/IL-9發(fā)揮抗腫瘤效應(yīng)。因此,本課題的研究目的是探討TNF-α在促進(jìn)Th9細(xì)胞生成中的作用,并闡明其作用機(jī)制,為腫瘤免疫治療提供新策略。方法:為了研究TNF-α在Th9細(xì)胞生成中的作用,通過(guò)流式細(xì)胞分選儀分選得到初始CD4~+T細(xì)胞(CD4~+CD25~-CD62L~(hi)),在Th9細(xì)胞極化條件下(抗CD3/CD28抗體和TGFβ/IL-4),加入或不加入TNF-α,體外誘導(dǎo)Th9細(xì)胞生成。然后以q PCR、ELISA和/或流式細(xì)胞儀檢測(cè)Th9細(xì)胞表達(dá)的IL-9 m RNA和蛋白水平,并檢測(cè)Th9細(xì)胞的存活情況及細(xì)胞活性。TNF-α受體包括TNFR1和TNFR2,首先通過(guò)流式細(xì)胞儀檢測(cè)初始CD4~+T細(xì)胞的TNFR1和TNFR2的表達(dá)情況。然后在Th9細(xì)胞極化條件下,加入TNFR1或TNFR2的封閉抗體,檢測(cè)封閉TNFR1或TNFR2能否影響TNF-α對(duì)Th9細(xì)胞生成的促進(jìn)作用。TNF/TNF受體家族成員OX40/OX40L、TL1A和GITR促進(jìn)Th9細(xì)胞生成依賴于NF-κB或STAT5信號(hào)通路,為了研究TNF-α誘導(dǎo)Th9細(xì)胞生成過(guò)程中是否活化了NF-κB或STAT信號(hào),在Th9細(xì)胞極化條件下,通過(guò)Western Blot檢測(cè)STAT分子的磷酸化水平。加入STAT5抑制劑或NF-κB抑制劑,檢測(cè)TNF-α能否促進(jìn)Th9細(xì)胞的生成。然后通過(guò)熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)進(jìn)一步驗(yàn)證NF-κB分子是否能結(jié)合并活化Il9啟動(dòng)子。結(jié)果:TNF-α顯著促進(jìn)了Th9細(xì)胞的生成,促進(jìn)了Th9細(xì)胞存活,并增強(qiáng)了Th9細(xì)胞的細(xì)胞活性。TNF-α誘導(dǎo)的Th9細(xì)胞除了Il5和Il13有少量增加外,不表達(dá)已知的Th9細(xì)胞相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子Pu.1和Irf4,以及其他Th細(xì)胞的特異性轉(zhuǎn)錄因子和細(xì)胞因子。初始CD4~+T細(xì)胞表達(dá)TNFR1和TNFR2,封閉TNFR2顯著抑制了TNF-α對(duì)Th9細(xì)胞生成的促進(jìn)作用,封閉TNFR1則不會(huì)抑制TNF-α對(duì)Th9細(xì)胞生成的促進(jìn)作用。TNF-α能活化STAT5,抑制STAT5減弱了TNF-α促進(jìn)Th9細(xì)胞生成的作用。而抑制NF-κB也能抑制TNF-α促進(jìn)Th9細(xì)胞生成的作用,且NF-κB分子能結(jié)合并活化Il9啟動(dòng)子,從而促進(jìn)IL-9的表達(dá)。結(jié)論:TNF-α通過(guò)TNFR2/STAT5和TNFR2/NF-κB信號(hào)通路來(lái)促進(jìn)Th9細(xì)胞的生成。
【關(guān)鍵詞】：Th9 IL-9 TNF-α TNFR2 STAT5 NF-κB
【學(xué)位授予單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R730.51
【目錄】：

• 中文摘要4-6
• Abstract6-13
• 第1章 緒論13-20
• 1.1 Th9細(xì)胞的發(fā)現(xiàn)13-14
• 1.2 Th9細(xì)胞的生成14-15
• 1.3 Th9細(xì)胞的調(diào)控15-16
• 1.4 Th9細(xì)胞與腫瘤免疫16-18
• 1.5 TNF-α 與Th細(xì)胞的關(guān)系18
• 1.6 本課題研究目的18-20
• 第2章 材料與方法20-30
• 2.1 材料20-23
• 2.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物20
• 2.1.2 主要試劑20-21
• 2.1.3 主要儀器21-22
• 2.1.4 主要試劑的配制22-23
• 2.2 方法23-30
• 2.2.1 分選初始CD4~+ T細(xì)胞（CD4~+ CD25~- CD62L~(hi)）23
• 2.2.2 體外誘導(dǎo)Th9細(xì)胞23-24
• 2.2.3 胞內(nèi)染色24
• 2.2.4 RNA的提取24-25
• 2.2.5 cDNA的合成25
• 2.2.6 qPCR25-27
• 2.2.7 ELISA27
• 2.2.8 Western Blot27-28
• 2.2.9 熒光素酶報(bào)告基因系統(tǒng)28-29
• 2.2.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法29-30
• 第3章 結(jié)果30-39
• 3.1 TNF-α 促進(jìn)Th9細(xì)胞的生成30-32
• 3.1.1 TNF-α 促進(jìn)Th9細(xì)胞生成30-31
• 3.1.2 TNF-α 誘導(dǎo)的Th9細(xì)胞不表達(dá)其他Th細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄因子和細(xì)胞因子31-32
• 3.2 TNF-α 促進(jìn)Th9細(xì)胞存活32-33
• 3.3 TNF-α 促進(jìn)Th9細(xì)胞表達(dá)CD4433-34
• 3.4 TNF-α 通過(guò)TNFR2促進(jìn)Th9細(xì)胞生成34-35
• 3.4.1 初始CD4~+ T細(xì)胞表達(dá)TNFR1和TNFR234
• 3.4.2 封閉TNFR2抑制TNF-α 對(duì)Th9細(xì)胞生成的促進(jìn)作用34-35
• 3.5 TNF-α 通過(guò)激活STAT5信號(hào)通路促進(jìn)Th9細(xì)胞的生成35-37
• 3.5.1 TNF-α 活化STAT535-36
• 3.5.2 抑制STAT5減弱TNF-α 對(duì)Th9細(xì)胞生成的促進(jìn)作用36-37
• 3.6 TNF-α 通過(guò)激活NF-κB信號(hào)通路促進(jìn)Th9細(xì)胞的生成37-39
• 3.6.1 抑制NF-κB減弱TNF-α 對(duì)Th9細(xì)胞生成的促進(jìn)作用37
• 3.6.2 熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)檢測(cè)NF-κB分子與Il9啟動(dòng)子的結(jié)合情況37-39
• 第4章 討論39-42
• 第5章 結(jié)論42-43
• 參考文獻(xiàn)43-48
• 作者簡(jiǎn)介及在學(xué)期間所取得的科研成果48-49
• 致謝49

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