本文關(guān)鍵詞：MANF對肝癌細(xì)胞惡性生物學(xué)行為的抑制作用

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【摘要】：肝細(xì)胞肝癌(Hepatocellular Carcinoma,HCC)是最常見的一種肝癌分型,是我國最常見的惡性腫瘤之一,病因復(fù)雜。盡管早期的診斷與治療有了顯著的提高,但由于缺乏適當(dāng)?shù)闹委煷胧?肝癌病人的生存率仍然微乎其微。肝癌通常是在慢性炎癥的基礎(chǔ)上由纖維化發(fā)展而來。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(endoplasmic reticulum,ER)應(yīng)激是在蛋白未折疊或者錯誤折疊時,激活未折疊蛋白反應(yīng)(unfold protein response,UPR),減少細(xì)胞內(nèi)的異常蛋白的堆積,從而保護細(xì)胞的一種真核細(xì)胞的保護性應(yīng)激反應(yīng)。已有研究表明,有很多的疾病的形成與發(fā)展均與ERS密切相關(guān)。中腦星形細(xì)胞來源的神經(jīng)生長因子(mesencephalic astrocyte-derived neurotrophic factor,MANF)是一個ER應(yīng)激敏感蛋白,ER應(yīng)激能上調(diào)其表達。本實驗室早期研究中發(fā)現(xiàn):在蛋白水平和m RNA水平,肝癌組織的MANF表達均高于癌旁組織,故推測,MANF可能在肝癌中起著重要的作用。因此,本文擬探究MANF對肝癌細(xì)胞的惡性生物學(xué)行為的影響。目的觀察MANF對肝癌細(xì)胞的體外增殖、遷移、侵潤及體內(nèi)成瘤的抑制作用。方法收集肝癌病人組織樣本,采用免疫組化方法觀察MANF蛋白在肝癌和癌旁組織中表達的差異;構(gòu)建穩(wěn)定的敲低MANF的肝癌細(xì)胞株,然后用MTT法、劃痕法、Transwell、軟克隆形成實驗分別觀察敲低MANF對腫瘤細(xì)胞增殖、遷移、侵襲以及單個細(xì)胞惡性增殖能力的影響;裸鼠成瘤實驗檢測MANF對腫瘤增長過程的影響。結(jié)果1.觀察MANF在HCC樣本中的表達對收集的HCC病人肝組織進行免疫組化染色發(fā)現(xiàn),在癌旁組織MANF蛋白表達上調(diào),而癌組織MANF蛋白表達低于癌旁組織。使用原位雜交的方法檢測MANF的m RNA時發(fā)現(xiàn),HCC病人肝癌組織MANF表達低于其自身癌旁組織。上述結(jié)果提示,在肝癌MANF的轉(zhuǎn)錄及翻譯是被抑制的。2.MANF對肝癌細(xì)胞增殖的影響構(gòu)建穩(wěn)定敲低MANF的肝癌細(xì)胞株及轉(zhuǎn)染對照載體的細(xì)胞株,利用MTT的方法檢測細(xì)胞增殖的活性。結(jié)果發(fā)現(xiàn)敲低MANF的肝癌細(xì)胞增殖率高于其載體對照,這一結(jié)果提示,MANF可以抑制肝癌細(xì)胞的增殖。3.MANF對肝癌細(xì)胞遷移能力的影響使用已構(gòu)建的穩(wěn)定敲低MANF的肝癌細(xì)胞株與其對照細(xì)胞株,利用劃痕實驗方法檢測MANF對肝癌細(xì)胞遷移能力的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)敲低MANF的肝癌細(xì)胞遷移能力高于其對照組細(xì)胞株,這一結(jié)果提示,MANF可以抑制肝癌細(xì)胞的遷移能力。4.MANF對肝癌細(xì)胞侵襲的影響使用已構(gòu)建的穩(wěn)定敲低MANF的肝癌細(xì)胞株與其對照細(xì)胞株,利用Transwell的方法檢測MANF對肝癌細(xì)胞侵襲能力的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)敲低MANF的肝癌細(xì)胞侵襲率高于其對照組,該結(jié)果提示,MANF可以抑制肝癌細(xì)胞的侵襲。5.MANF對肝癌細(xì)胞惡性克隆能力的影響使用已構(gòu)建的穩(wěn)定敲低MANF的肝癌細(xì)胞株與其對照細(xì)胞株,利用平板克隆形成實驗與軟克隆瓊脂形成實驗方法檢測MANF對肝癌細(xì)胞惡性克隆能力的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)敲低MANF的肝癌細(xì)胞惡性克隆能力高于其對照組細(xì)胞株,這一結(jié)果提示,MANF可以抑制肝癌細(xì)胞的惡性克隆形成。6.MANF對裸鼠成瘤的影響在裸鼠成瘤實驗中,我們從南京模式動物研究所購買了4-6周的雌性裸鼠,經(jīng)適應(yīng)性培養(yǎng)后,隨機分為兩組,一組皮下注射了穩(wěn)定敲低MANF的肝癌細(xì)胞,另一組注射未敲低MANF的對照的肝癌細(xì)胞。結(jié)果發(fā)現(xiàn),注射敲低MANF肝癌細(xì)胞的裸鼠皮下腫瘤大于注射未敲低MANF肝癌細(xì)胞的裸鼠腫瘤。在裸鼠成瘤后,我們對皮下注射了穩(wěn)定敲低MANF的肝癌細(xì)胞的裸鼠再給予尾靜脈注射MANF與其對照PBS治療。結(jié)果發(fā)現(xiàn),注射MANF治療的裸鼠腫瘤小于注射PBS的裸鼠腫瘤。這一結(jié)果提示,MANF可以抑制裸鼠腫瘤的生長。結(jié)論:1.MANF在HCC中的表達下調(diào);2.MANF可以抑制肝癌細(xì)胞的增殖、遷移、侵襲以及單個細(xì)胞惡性增殖能力;3.MANF可以抑制裸鼠移植瘤的生長。
【關(guān)鍵詞】：肝細(xì)胞肝癌 神經(jīng)營養(yǎng)因子 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激 腫瘤惡性生物學(xué)行為
【學(xué)位授予單位】：安徽醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R735.7
【目錄】：

• 英文縮略詞表(Abbreviation)6-8
• 中文摘要8-11
• 英文摘要11-15
• 1 前言15-16
• 2 實驗材料16-20
• 2.1 標(biāo)本制備16
• 2.2 實驗動物16
• 2.3 細(xì)胞株16
• 2.4 質(zhì)粒16
• 2.5 抗體16-17
• 2.6 引物17
• 2.7 主要試劑17-19
• 2.8 實驗儀器19-20
• 3 實驗方法20-33
• 3.1 免疫組織化學(xué)20-21
• 3.2 MTT21
• 3.3 Transwell侵襲21-22
• 3.4 劃痕22
• 3.5 軟瓊脂克隆形成實驗22-23
• 3.6 平板克隆形成實驗23
• 3.7 重組人MANF蛋白的制備23-28
• 3.8 慢病毒感染構(gòu)建穩(wěn)定表達株28-29
• 3.9 裸鼠成瘤實驗29-30
• 3.10 免疫印跡(Western blot)30-32
• 3.11 HE染色32-33
• 3.12 結(jié)果分析33
• 4 結(jié)果33-43
• 4.1 觀察MANF在HCC組織中的表達水平..33-34
• 4.2 沉默MANF對肝癌細(xì)胞的增殖有促進作用34
• 4.3 MANF可以抑制肝癌細(xì)胞的遷移34-36
• 4.4 MANF可以抑制肝癌細(xì)胞的侵襲36-37
• 4.5 MANF可以抑制肝癌細(xì)胞的惡性增殖37-39
• 4.6 構(gòu)建穩(wěn)定敲低MANF的肝癌細(xì)胞株39-40
• 4.7 MANF蛋白的誘導(dǎo)及純化40
• 4.8 MANF抑制裸鼠成瘤的影響40-43
• 5 討論43-44
• 6 結(jié)論44-45
• 參考文獻45-48
• 附錄48-49
• 致謝49-51
• 綜述51-56
• 參考文獻55-56

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