本文關(guān)鍵詞：沉默NMHC Ⅱ不同亞型基因?qū)θ橄侔w內(nèi)外生物學(xué)行為的影響

  更多相關(guān)文章： 非肌細(xì)胞肌球蛋白Ⅱ 腫瘤轉(zhuǎn)移 乳腺癌

【摘要】：乳腺癌是危害女性健康的惡性腫瘤之一，腫瘤轉(zhuǎn)移是惡性腫瘤的主要特征，腫瘤的轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)是治愈乳腺癌的最大障礙，也是乳腺癌患者死亡的主要原因。研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移與遷移蛋白的調(diào)節(jié)有關(guān)，而非肌細(xì)胞肌球蛋白作為馬達(dá)蛋白家族成員在細(xì)胞運(yùn)動(dòng)調(diào)節(jié)中起關(guān)鍵作用，因此，非肌細(xì)胞肌球蛋白在腫瘤轉(zhuǎn)移中的作用已經(jīng)引起研究者們的關(guān)注。 非肌細(xì)胞肌球蛋白Ⅱ（Nonmuscle Myosin Ⅱ,NMⅡ）是細(xì)胞骨架的重要組成成分，，也是馬達(dá)蛋白超家族的成員，不僅為細(xì)胞內(nèi)分子運(yùn)動(dòng)提供動(dòng)力，也參與細(xì)胞內(nèi)各種生理活動(dòng)。腫瘤轉(zhuǎn)移的起始階段包括細(xì)胞的極化、粘附改變、細(xì)胞遷移。而NMⅡ不僅參與細(xì)胞運(yùn)動(dòng)，也是細(xì)胞極化和細(xì)胞粘附的重要調(diào)節(jié)器，因此，我們推測(cè)，NMⅡ參與腫瘤轉(zhuǎn)移的調(diào)節(jié)。NMⅡ由兩條230KD的重鏈（Nonmuscle Myosin Heavy Chain），一對(duì)20KD的調(diào)節(jié)輕鏈（Regulatory LightChain, RLC），和一對(duì)17KD的關(guān)鍵輕鏈（Essential Light Chain, ELC）組成。在細(xì)胞運(yùn)動(dòng)過(guò)程中，輕鏈起穩(wěn)定和調(diào)節(jié)作用，重鏈與肌動(dòng)蛋白結(jié)合直接調(diào)節(jié)細(xì)胞運(yùn)動(dòng)力。根據(jù)重鏈不同，NMHCⅡ可分為NMHCⅡA，NMHCⅡB和NMHCⅡC三種亞型，分別由MYH9，MYH10和MYH14基因編碼。 在前期工作中，我們?cè)谌橄侔┙M織和乳腺癌MCF-7細(xì)胞中，均檢測(cè)到NMHCⅡA和NMHCⅡB兩個(gè)亞型，未檢測(cè)到NMHCⅡC；NMHCⅡA、B兩個(gè)亞型在乳腺癌組織和細(xì)胞中的表達(dá)均高于它們?cè)谡Ｈ橄俳M織和細(xì)胞中的表達(dá)；且淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組表達(dá)明顯增高。因此，我們認(rèn)為NMHCⅡ與乳腺癌的惡性程度及轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。 目的： 利用RNAi干擾技術(shù)，建立穩(wěn)定沉默NMHCⅡ不同亞型的細(xì)胞株，通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)及NOD/SCID小鼠體內(nèi)移植瘤模型研究沉默不同亞型的細(xì)胞對(duì)乳腺癌MCF-7細(xì)胞增殖、侵襲等生物學(xué)行為的影響。 方法： 1.采用RNAi技術(shù)分別沉默MCF-7細(xì)胞的NMHCⅡA、NMHCⅡB基因，并篩選出各自的穩(wěn)定細(xì)胞株。篩選出的穩(wěn)定細(xì)胞株作為RNAi實(shí)驗(yàn)組，以空載質(zhì)粒組和未轉(zhuǎn)染MCF-7細(xì)胞組作為對(duì)照組。并利用Western Blot和免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)檢測(cè)沉默效率。 2.通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)研究沉默NMHCⅡ不同亞型基因?qū)θ橄侔㎝CF-7細(xì)胞生物學(xué)行為的影響。 （1）應(yīng)用CCK-8試劑盒檢測(cè)不同NMHCⅡ基因?qū)CF-7細(xì)胞增殖的影響。 （2）通過(guò)流式細(xì)胞儀檢測(cè)沉默各亞型后，細(xì)胞周期的變化。 （3）通過(guò)細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移能力的改變。 （4）利用Boyden小室體外侵襲試驗(yàn)檢測(cè)不同NMHCⅡ亞型對(duì)MCF-7細(xì)胞侵襲能力的影響。 3.通過(guò)構(gòu)建NOD/SCID小鼠自發(fā)轉(zhuǎn)移動(dòng)物模型，體內(nèi)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證確已沉默NMHCⅡ亞型，并觀察NMHCⅡ不同亞型對(duì)腫瘤生長(zhǎng)轉(zhuǎn)移的影響。 （1）通過(guò)免疫組織化學(xué)染色觀察腫瘤內(nèi)NMHCⅡA、NMHCⅡB的表達(dá)情況。 （2）通過(guò)腫瘤大體、組織學(xué)觀察NMHCⅡ不同亞型缺失對(duì)NOD/SCID小鼠成瘤的影響。 （3）通過(guò)PCNA、Caspase-3、MMP2免疫組織化學(xué)染色，檢測(cè)NMHCⅡ?qū)OD/SCID小鼠腫瘤組織增殖、凋亡、侵襲能力的影響。 （4）通過(guò)各臟器的觀察，檢測(cè)是否有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。 結(jié)果： 1.得到穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞株，通過(guò)Western Blot和免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)染色鑒定轉(zhuǎn)染結(jié)果發(fā)現(xiàn)，RNAiⅡB組與對(duì)照組相比，NMHCⅡB表達(dá)明顯下降，NMHCⅡA的表達(dá)無(wú)影響；RNAiⅡA組與對(duì)照組相比，NMHCⅡA表達(dá)下降，同時(shí)NMHCⅡB的表達(dá)也明顯下調(diào)。 2.體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示： （1）CCK-8試劑盒檢測(cè)結(jié)果和流式細(xì)胞儀檢測(cè)周期結(jié)果均顯示，沉默NMHCⅡA和NMHCⅡB均可導(dǎo)致細(xì)胞增殖能力的下降。 （2）細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，沉默NMHCⅡA和NMHCⅡB后，細(xì)胞遷移率略快于對(duì)照組，但各組間表達(dá)無(wú)差異。 （3）Boyden小室侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，沉默NMHCⅡA和NMHCⅡB后，細(xì)胞穿過(guò)人工基底膜的細(xì)胞少于對(duì)照組，但RNAiⅡA與RNAiⅡB兩組間表達(dá)無(wú)差異。 3.通過(guò)NOD/SCID小鼠自發(fā)轉(zhuǎn)移動(dòng)物模型體內(nèi)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，確已沉默NMHCⅡ亞型，NMHCⅡA、ⅡB沉默組小鼠腫瘤壞死嚴(yán)重，小鼠腫瘤組織PCNA表達(dá)均弱于對(duì)照組，Caspase-3表達(dá)均強(qiáng)于對(duì)照組，MMP2的表達(dá)弱于對(duì)照組。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)各組均無(wú)明顯轉(zhuǎn)移。 結(jié)論： 1.NMHCⅡA與NMHCⅡB之間存在調(diào)控關(guān)系，NMHCⅡA影響NMHCⅡB的表達(dá)。 2.NMHCⅡA和NMHCⅡB對(duì)MCF-7細(xì)胞的增殖和侵襲有調(diào)節(jié)作用。 3.缺失NMHCⅡ的MCF-7細(xì)胞在NOD/SCID鼠中所形成的腫瘤壞死明顯，可能與NMHCⅡ的缺失抑制增殖、促進(jìn)凋亡有關(guān)。
【關(guān)鍵詞】：非肌細(xì)胞肌球蛋白Ⅱ 腫瘤轉(zhuǎn)移 乳腺癌
【學(xué)位授予單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R737.9
【目錄】：

• 中文摘要4-7
• Abstract7-11
• 英文縮略詞11-15
• 第1章 文獻(xiàn)綜述15-26
• 1.1 乳腺癌概況15-16
• 1.2 非肌細(xì)胞肌球蛋白Ⅱ概述16-21
• 1.2.1 結(jié)構(gòu)與功能16-17
• 1.2.2 分型17-18
• 1.2.3 NMⅡ與細(xì)胞運(yùn)動(dòng)的關(guān)系18-21
• 1.3 NMⅡ與腫瘤的關(guān)系21-26
• 1.3.1 NMⅡ與腫瘤轉(zhuǎn)移的關(guān)系21-22
• 1.3.2 NMⅡ?qū)δ[瘤轉(zhuǎn)移的調(diào)節(jié)22-24
• 1.3.3 NMHCⅡ在腫瘤中的作用24-26
• 第2章 實(shí)驗(yàn)材料與方法26-38
• 2.1 實(shí)驗(yàn)材料26-30
• 2.1.1 細(xì)胞系26
• 2.1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物26
• 2.1.3 質(zhì)粒和菌株26
• 2.1.4 主要試劑26-27
• 2.1.5 主要儀器27-28
• 2.1.6 主要試劑的配制28-30
• 2.2 實(shí)驗(yàn)方法30-37
• 2.2.1 質(zhì)粒載體的構(gòu)建30
• 2.2.2 細(xì)胞轉(zhuǎn)染和克隆篩選30-31
• 2.2.3 Western Blot31-33
• 2.2.4 免疫細(xì)胞化學(xué)染色33-34
• 2.2.5 CCK-8 法繪制生長(zhǎng)曲線34
• 2.2.6 細(xì)胞周期檢測(cè)34-35
• 2.2.7 細(xì)胞劃痕法35
• 2.2.8 Boyden 小室體外侵襲實(shí)驗(yàn)35-36
• 2.2.9 NOD/SCID 鼠體內(nèi)荷瘤模型建立36
• 2.2.10 組織石蠟切片 HE 染色、免疫組織化學(xué)染色36-37
• 2.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析37-38
• 第3章 結(jié)果38-56
• 3.1 穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞克隆的篩選及鑒定38-41
• 3.1.1 穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株的建立38
• 3.1.2 穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株的鑒定38-41
• 3.2 體外實(shí)驗(yàn)檢測(cè)沉默 NMHCⅡ各亞型對(duì) MCF-7 細(xì)胞生物學(xué)行為的影響41-45
• 3.2.1 沉默 NMHCⅡ各亞型對(duì) MCF-7 細(xì)胞增殖的影響41-43
• 3.2.2 沉默 NMHCⅡ各亞型對(duì) MCF-7 細(xì)胞遷移的影響43-44
• 3.2.3 沉默 NMHCⅡ各亞型對(duì) MCF-7 細(xì)胞侵襲的影響44-45
• 3.3 沉默 NMHCⅡ各亞型對(duì) MCF-7 細(xì)胞體內(nèi)成瘤能力的影響45-49
• 3.3.1 NOD/SCID 小鼠體內(nèi)荷瘤動(dòng)物模型的建立45-47
• 3.3.2 檢測(cè) NOD/SCID 小鼠腫瘤組織中 NMHCⅡ亞型的表達(dá)47-49
• 3.4 體內(nèi)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)沉默NMHCⅡ各亞型對(duì)MCF-7細(xì)胞生物學(xué)行為的影響49-56
• 3.4.1 免疫細(xì)胞化學(xué)檢測(cè)沉默NMHCⅡ?qū)OD/SCID小鼠腫瘤組織增殖能力的影響49-51
• 3.4.2 免疫細(xì)胞化學(xué)檢測(cè)沉默NMHCⅡ?qū)OD/SCID小鼠腫瘤組織凋亡能力的影響51-53
• 3.4.3 免疫細(xì)胞化學(xué)檢測(cè)沉默NMHCⅡ?qū)OD/SCID小鼠腫瘤組織轉(zhuǎn)移能力的影響53-56
• 第4章 討論56-62
• 4.1 RNAi 干擾穩(wěn)定下調(diào) MCF-7 細(xì)胞中 NMHCⅡ各亞型的表達(dá)56-57
• 4.2 沉默 NMHCⅡ各亞型對(duì) MCF-7 細(xì)胞生物學(xué)行為的影響57-60
• 4.2.1 沉默 NMHCⅡ各亞型對(duì) MCF-7 細(xì)胞增殖和凋亡的影響57-58
• 4.2.2 沉默 NMHCⅡ各亞型對(duì) MCF-7 細(xì)胞遷移和侵襲的影響58-60
• 4.3 沉默 NMHCⅡ各亞型對(duì) MCF-7 細(xì)胞體內(nèi)成瘤能力的影響60-62
• 第5章 結(jié)論62-63
• 參考文獻(xiàn)63-71
• 作者簡(jiǎn)介及在學(xué)期間所獲得的科研成果71-72
• 致謝72

【參考文獻(xiàn)】

中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前3條

1 羅年安;屈亞琦;董瑞;;乳腺癌的治療進(jìn)展[J];現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)進(jìn)展;2015年01期

2 高鳳霞;;乳腺癌轉(zhuǎn)移的相關(guān)因素研究進(jìn)展綜述[J];醫(yī)學(xué)信息(中旬刊);2011年01期

3 楊景明;鄧為民;;保乳術(shù)后復(fù)發(fā)性乳腺癌的治療進(jìn)展[J];醫(yī)學(xué)綜述;2011年15期

本文編號(hào)：903271