本文關(guān)鍵詞：沉默NMHC Ⅱ不同亞型基因?qū)θ橄侔w內(nèi)外生物學行為的影響

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【摘要】：乳腺癌是危害女性健康的惡性腫瘤之一，腫瘤轉(zhuǎn)移是惡性腫瘤的主要特征，腫瘤的轉(zhuǎn)移和復發(fā)是治愈乳腺癌的最大障礙，也是乳腺癌患者死亡的主要原因。研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移與遷移蛋白的調(diào)節(jié)有關(guān)，而非肌細胞肌球蛋白作為馬達蛋白家族成員在細胞運動調(diào)節(jié)中起關(guān)鍵作用，因此，非肌細胞肌球蛋白在腫瘤轉(zhuǎn)移中的作用已經(jīng)引起研究者們的關(guān)注。 非肌細胞肌球蛋白Ⅱ（Nonmuscle Myosin Ⅱ,NMⅡ）是細胞骨架的重要組成成分，，也是馬達蛋白超家族的成員，不僅為細胞內(nèi)分子運動提供動力，也參與細胞內(nèi)各種生理活動。腫瘤轉(zhuǎn)移的起始階段包括細胞的極化、粘附改變、細胞遷移。而NMⅡ不僅參與細胞運動，也是細胞極化和細胞粘附的重要調(diào)節(jié)器，因此，我們推測，NMⅡ參與腫瘤轉(zhuǎn)移的調(diào)節(jié)。NMⅡ由兩條230KD的重鏈（Nonmuscle Myosin Heavy Chain），一對20KD的調(diào)節(jié)輕鏈（Regulatory LightChain, RLC），和一對17KD的關(guān)鍵輕鏈（Essential Light Chain, ELC）組成。在細胞運動過程中，輕鏈起穩(wěn)定和調(diào)節(jié)作用，重鏈與肌動蛋白結(jié)合直接調(diào)節(jié)細胞運動力。根據(jù)重鏈不同，NMHCⅡ可分為NMHCⅡA，NMHCⅡB和NMHCⅡC三種亞型，分別由MYH9，MYH10和MYH14基因編碼。 在前期工作中，我們在乳腺癌組織和乳腺癌MCF-7細胞中，均檢測到NMHCⅡA和NMHCⅡB兩個亞型，未檢測到NMHCⅡC；NMHCⅡA、B兩個亞型在乳腺癌組織和細胞中的表達均高于它們在正常乳腺組織和細胞中的表達；且淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組表達明顯增高。因此，我們認為NMHCⅡ與乳腺癌的惡性程度及轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。 目的： 利用RNAi干擾技術(shù)，建立穩(wěn)定沉默NMHCⅡ不同亞型的細胞株，通過體外實驗及NOD/SCID小鼠體內(nèi)移植瘤模型研究沉默不同亞型的細胞對乳腺癌MCF-7細胞增殖、侵襲等生物學行為的影響。 方法： 1.采用RNAi技術(shù)分別沉默MCF-7細胞的NMHCⅡA、NMHCⅡB基因，并篩選出各自的穩(wěn)定細胞株。篩選出的穩(wěn)定細胞株作為RNAi實驗組，以空載質(zhì)粒組和未轉(zhuǎn)染MCF-7細胞組作為對照組。并利用Western Blot和免疫細胞化學技術(shù)檢測沉默效率。 2.通過體外實驗研究沉默NMHCⅡ不同亞型基因?qū)θ橄侔㎝CF-7細胞生物學行為的影響。 （1）應用CCK-8試劑盒檢測不同NMHCⅡ基因?qū)CF-7細胞增殖的影響。 （2）通過流式細胞儀檢測沉默各亞型后，細胞周期的變化。 （3）通過細胞劃痕實驗檢測細胞遷移能力的改變。 （4）利用Boyden小室體外侵襲試驗檢測不同NMHCⅡ亞型對MCF-7細胞侵襲能力的影響。 3.通過構(gòu)建NOD/SCID小鼠自發(fā)轉(zhuǎn)移動物模型，體內(nèi)實驗驗證確已沉默NMHCⅡ亞型，并觀察NMHCⅡ不同亞型對腫瘤生長轉(zhuǎn)移的影響。 （1）通過免疫組織化學染色觀察腫瘤內(nèi)NMHCⅡA、NMHCⅡB的表達情況。 （2）通過腫瘤大體、組織學觀察NMHCⅡ不同亞型缺失對NOD/SCID小鼠成瘤的影響。 （3）通過PCNA、Caspase-3、MMP2免疫組織化學染色，檢測NMHCⅡ?qū)OD/SCID小鼠腫瘤組織增殖、凋亡、侵襲能力的影響。 （4）通過各臟器的觀察，檢測是否有遠處轉(zhuǎn)移。 結(jié)果： 1.得到穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細胞株，通過Western Blot和免疫細胞化學技術(shù)染色鑒定轉(zhuǎn)染結(jié)果發(fā)現(xiàn)，RNAiⅡB組與對照組相比，NMHCⅡB表達明顯下降，NMHCⅡA的表達無影響；RNAiⅡA組與對照組相比，NMHCⅡA表達下降，同時NMHCⅡB的表達也明顯下調(diào)。 2.體外實驗結(jié)果顯示： （1）CCK-8試劑盒檢測結(jié)果和流式細胞儀檢測周期結(jié)果均顯示，沉默NMHCⅡA和NMHCⅡB均可導致細胞增殖能力的下降。 （2）細胞劃痕實驗結(jié)果表明，沉默NMHCⅡA和NMHCⅡB后，細胞遷移率略快于對照組，但各組間表達無差異。 （3）Boyden小室侵襲實驗結(jié)果顯示，沉默NMHCⅡA和NMHCⅡB后，細胞穿過人工基底膜的細胞少于對照組，但RNAiⅡA與RNAiⅡB兩組間表達無差異。 3.通過NOD/SCID小鼠自發(fā)轉(zhuǎn)移動物模型體內(nèi)實驗結(jié)果顯示，確已沉默NMHCⅡ亞型，NMHCⅡA、ⅡB沉默組小鼠腫瘤壞死嚴重，小鼠腫瘤組織PCNA表達均弱于對照組，Caspase-3表達均強于對照組，MMP2的表達弱于對照組。體內(nèi)實驗各組均無明顯轉(zhuǎn)移。 結(jié)論： 1.NMHCⅡA與NMHCⅡB之間存在調(diào)控關(guān)系，NMHCⅡA影響NMHCⅡB的表達。 2.NMHCⅡA和NMHCⅡB對MCF-7細胞的增殖和侵襲有調(diào)節(jié)作用。 3.缺失NMHCⅡ的MCF-7細胞在NOD/SCID鼠中所形成的腫瘤壞死明顯，可能與NMHCⅡ的缺失抑制增殖、促進凋亡有關(guān)。
【關(guān)鍵詞】：非肌細胞肌球蛋白Ⅱ 腫瘤轉(zhuǎn)移 乳腺癌
【學位授予單位】：吉林大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R737.9
【目錄】：

• 中文摘要4-7
• Abstract7-11
• 英文縮略詞11-15
• 第1章 文獻綜述15-26
• 1.1 乳腺癌概況15-16
• 1.2 非肌細胞肌球蛋白Ⅱ概述16-21
• 1.2.1 結(jié)構(gòu)與功能16-17
• 1.2.2 分型17-18
• 1.2.3 NMⅡ與細胞運動的關(guān)系18-21
• 1.3 NMⅡ與腫瘤的關(guān)系21-26
• 1.3.1 NMⅡ與腫瘤轉(zhuǎn)移的關(guān)系21-22
• 1.3.2 NMⅡ?qū)δ[瘤轉(zhuǎn)移的調(diào)節(jié)22-24
• 1.3.3 NMHCⅡ在腫瘤中的作用24-26
• 第2章 實驗材料與方法26-38
• 2.1 實驗材料26-30
• 2.1.1 細胞系26
• 2.1.2 實驗動物26
• 2.1.3 質(zhì)粒和菌株26
• 2.1.4 主要試劑26-27
• 2.1.5 主要儀器27-28
• 2.1.6 主要試劑的配制28-30
• 2.2 實驗方法30-37
• 2.2.1 質(zhì)粒載體的構(gòu)建30
• 2.2.2 細胞轉(zhuǎn)染和克隆篩選30-31
• 2.2.3 Western Blot31-33
• 2.2.4 免疫細胞化學染色33-34
• 2.2.5 CCK-8 法繪制生長曲線34
• 2.2.6 細胞周期檢測34-35
• 2.2.7 細胞劃痕法35
• 2.2.8 Boyden 小室體外侵襲實驗35-36
• 2.2.9 NOD/SCID 鼠體內(nèi)荷瘤模型建立36
• 2.2.10 組織石蠟切片 HE 染色、免疫組織化學染色36-37
• 2.3 統(tǒng)計學分析37-38
• 第3章 結(jié)果38-56
• 3.1 穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞克隆的篩選及鑒定38-41
• 3.1.1 穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞株的建立38
• 3.1.2 穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞株的鑒定38-41
• 3.2 體外實驗檢測沉默 NMHCⅡ各亞型對 MCF-7 細胞生物學行為的影響41-45
• 3.2.1 沉默 NMHCⅡ各亞型對 MCF-7 細胞增殖的影響41-43
• 3.2.2 沉默 NMHCⅡ各亞型對 MCF-7 細胞遷移的影響43-44
• 3.2.3 沉默 NMHCⅡ各亞型對 MCF-7 細胞侵襲的影響44-45
• 3.3 沉默 NMHCⅡ各亞型對 MCF-7 細胞體內(nèi)成瘤能力的影響45-49
• 3.3.1 NOD/SCID 小鼠體內(nèi)荷瘤動物模型的建立45-47
• 3.3.2 檢測 NOD/SCID 小鼠腫瘤組織中 NMHCⅡ亞型的表達47-49
• 3.4 體內(nèi)實驗檢測沉默NMHCⅡ各亞型對MCF-7細胞生物學行為的影響49-56
• 3.4.1 免疫細胞化學檢測沉默NMHCⅡ?qū)OD/SCID小鼠腫瘤組織增殖能力的影響49-51
• 3.4.2 免疫細胞化學檢測沉默NMHCⅡ?qū)OD/SCID小鼠腫瘤組織凋亡能力的影響51-53
• 3.4.3 免疫細胞化學檢測沉默NMHCⅡ?qū)OD/SCID小鼠腫瘤組織轉(zhuǎn)移能力的影響53-56
• 第4章 討論56-62
• 4.1 RNAi 干擾穩(wěn)定下調(diào) MCF-7 細胞中 NMHCⅡ各亞型的表達56-57
• 4.2 沉默 NMHCⅡ各亞型對 MCF-7 細胞生物學行為的影響57-60
• 4.2.1 沉默 NMHCⅡ各亞型對 MCF-7 細胞增殖和凋亡的影響57-58
• 4.2.2 沉默 NMHCⅡ各亞型對 MCF-7 細胞遷移和侵襲的影響58-60
• 4.3 沉默 NMHCⅡ各亞型對 MCF-7 細胞體內(nèi)成瘤能力的影響60-62
• 第5章 結(jié)論62-63
• 參考文獻63-71
• 作者簡介及在學期間所獲得的科研成果71-72
• 致謝72

【參考文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前3條

1 羅年安;屈亞琦;董瑞;;乳腺癌的治療進展[J];現(xiàn)代生物醫(yī)學進展;2015年01期

2 高鳳霞;;乳腺癌轉(zhuǎn)移的相關(guān)因素研究進展綜述[J];醫(yī)學信息(中旬刊);2011年01期

3 楊景明;鄧為民;;保乳術(shù)后復發(fā)性乳腺癌的治療進展[J];醫(yī)學綜述;2011年15期

本文編號：903271