發(fā)布時間：2017-09-22 11:43

  本文關鍵詞：抗PSMA適配子介導的細胞自噬與促凋亡系統(tǒng)的構建及其抗前列腺癌功能的初步研究

  更多相關文章： 前列腺癌 進化保守區(qū) 融合蛋白 鏈霉親和素 前列腺特異性膜抗原 適配子 NuBCP-9-r8 自噬 凋亡

【摘要】：目的:構建自噬相關基因Beclin1的進化保守區(qū)ECD(evolutionary conserved district,ECD)和鏈霉親和素(streptavidin,SA)重組質粒,表達純化SA-ECD融合蛋白;建立抗PSMA適配子介導的自噬分子ECD和促凋亡開關分子NuBCP-9-r8靶向系統(tǒng)并初步研究其對前列腺癌細胞的功能。方法:首先采用基因合成技術獲取靶基因SA-ECD,為了給下一步蛋白表達做準備,對目的序列進行密碼子優(yōu)化,并且在其前面添加了起始密碼子ATG和一個His標簽,共1011bp;然后克隆至pUC57載體鑒定無誤后,再將其定向插入原核表達載體pET30a,以NdeI和HindⅢ作為酶切位點進行引物設計用于聚合酶鏈式反應(polymerase chain reaction,PCR)及雙酶切鑒定篩選陽性克隆,隨后進行序列測定。測序分析正確后,將pET30a-SA-ECD轉化至BL21作為表達菌株,以IPTG終濃度1mmol/l,15℃誘導16h,37℃誘導4h作為表達的摸索條件。獲得的sa-ecd融合蛋白由鎳親和凝膠層析柱及westernblotting分別進行純化與鑒定。細胞穿膜實驗鑒定八聚精氨酸(r8)的穿膜效率;利用鏈霉親和素-生物素間高效特異結合的特性將融合蛋白sa-ecd、生物素標記的抗psma適配子及nubcp-9-r8按一定比例偶聯(lián)起來,構建抗psma適配子靶向的細胞自噬和促凋亡系統(tǒng),并采用emsa檢測sa-ecd與生物素標記的抗psma適配子及nubcp-9-r8間的結合力;采用cck-8(cellcountingkit-8)、流式細胞術(flowcytometry,fcm)、臺盼藍染色、細胞形態(tài)學分析、吖啶橙染色、westernblotting等方法初步驗證其對前列腺癌細胞的自噬與凋亡的誘導作用。結果:雙酶切及基因測序證實重組質粒pet30a-sa-ecd構建成功;sa-ecd融合蛋白(含his標簽)經iptg誘導在大腸桿菌中得以表達,低溫且延長時間更利于蛋白的表達,所以選擇iptg終濃度1mmol/l,15℃誘導16h作為表達的優(yōu)化條件進行大量誘導表達;但融合蛋白sa-ecd主要存在于包涵體中,可溶性不足10%;為此,我們放大表達系統(tǒng),對培養(yǎng)上清中的sa-ecd蛋白進行鎳親和凝膠層析柱純化及westernblotting鑒定,驗證其大小約為38kd,與理論相一致。熒光顯微鏡下觀察到,與fitc-nubcp-9相比,fitc-nubcp-9-r8的熒光強度明顯增強,說明八聚精氨酸(r8)能高效的穿過細胞膜;emsa實驗結果可見,與biotin-a10/nubcp-9-r8組相比,sa-ecd+biotin-a10/nubcp-9-r8組呈現明顯滯后的條帶,而bsa+biotin-a10/nubcp-9-r8組則沒有明顯變化,證明融合蛋白sa-ecd能有效結合生物素標記的抗psma適配子及nubcp-9-r8;成功構建抗psma適配子靶向的細胞自噬和促凋亡系統(tǒng),cck-8法檢測lncap細胞存活率,結果顯示靶向系統(tǒng)組對細胞的殺傷效果與sa-ecd組及a10-nubcp-9-r8組相比差異具有顯著性(p0.01);流式細胞術顯示濃度0-40μg/ml的靶向系統(tǒng)組引起lncap細胞總凋亡百分率分別為(4.6±1.53)%、(6.98±2.12)%、(16.60±2.48)%、(42.03±2.28)%及(70.66±1.95)%,除5μg/ml組外,與陰性對照組的細胞凋亡率相比,差異均有統(tǒng)計學意義(p0.01);臺盼藍染色中與對照組相比,sa-ecd組中l(wèi)ncap、c4-2、pc-3及hela的細胞活力下降(p0.05),a10-nubcp-9-r8組中上述四種細胞的細胞活力沒有明顯變化(p0.05),而靶向系統(tǒng)組中l(wèi)ncap和c4-2的細胞活力顯著降低(P0.01),說明靶向系統(tǒng)對PSMA(+)前列腺癌細胞有顯著的殺傷作用;形態(tài)學分析結果進一步從形態(tài)學方面證實上述結論;吖啶橙和Western blotting檢測顯示靶向系統(tǒng)在一定濃度范圍內,既能誘導LNCaP細胞自噬又能促進其凋亡。結論:本研究成功構建pET30a-SA-ECD重組質粒并表達純化出融合蛋白SA-ECD;構建的抗PSMA適配子靶向的細胞自噬和促凋亡系統(tǒng)顯示其對PSMA(+)前列腺癌細胞有殺傷作用,為探索治療前列腺癌的新途徑奠定了基礎。
【關鍵詞】：前列腺癌 進化保守區(qū) 融合蛋白 鏈霉親和素 前列腺特異性膜抗原 適配子 NuBCP-9-r8 自噬 凋亡
【學位授予單位】：第四軍醫(yī)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R737.25
【目錄】：

• 縮略語表6-8
• 中文摘要8-11
• 英文摘要11-14
• 前言14-15
• 文獻回顧15-26
• 第一部分 重組表達質粒pET 30a-SA-ECD的構建26-41
• 引言26
• 1 材料26-28
• 1.1 載體26-27
• 1.2 菌種27
• 1.3 主要試劑及緩沖液27
• 1.4 常用培養(yǎng)基、瓊脂糖凝膠及其配制方法27-28
• 1.5 主要儀器28
• 2 方法28-34
• 2.1 目的基因的設計28-32
• 2.2 載體的準備32-33
• 2.3 載體與目的基因連接33
• 2.4 重組質粒鑒定33-34
• 3 結果34-39
• 3.1 目的基因鑒定34-36
• 3.2 重組表達質粒的鑒定結果36-39
• 4 討論39-41
• 第二部分 融合蛋白SA-ECD的表達與純化41-51
• 引言41
• 1 材料41-42
• 1.1 菌種41
• 1.2 主要試劑、緩沖液41-42
• 1.3 常用試劑、緩沖液及培養(yǎng)基的配制方法42
• 1.4 主要儀器42
• 2 方法42-46
• 2.1 融合蛋白的誘導表達及Western-blot初步鑒定42-44
• 2.2 融合蛋白的大量誘導表達及其純化、鑒定44-45
• 2.3 Bradford法測定蛋白濃度45-46
• 3 結果46-49
• 3.1 成功表達并初步鑒定融合蛋白SA-ECD46-47
• 3.2 成功純化并鑒定融合蛋白SA-ECD47-48
• 3.3 蛋白濃度測定48-49
• 4 討論49-51
• 第三部分 靶向系統(tǒng)的構建及其抗前列腺癌功能的初步研究51-66
• 引言51
• 1 材料51-52
• 1.1 細胞51
• 1.2 主要試劑51-52
• 1.3 主要儀器52
• 2 方法52-56
• 2.1 靶向系統(tǒng)的構建52-53
• 2.2 電泳遷移率試驗（EMSA）53-54
• 2.3 CCK-8 法檢測細胞存活率54
• 2.4 細胞凋亡檢測54
• 2.5 臺盼蘭染色法鑒定細胞活力54-55
• 2.6 形態(tài)學觀察55
• 2.7 細胞自噬形態(tài)學觀察55
• 2.8 Western blot檢測相關蛋白表達55-56
• 2.9 統(tǒng)計學方法56
• 3 結果56-64
• 3.1 八聚精氨酸（R_8）能高效的穿過細胞膜56-57
• 3.2 SA-ECD可特異性結合A10-biotin及biotin-NuBCP9R_857-58
• 3.3 靶向系統(tǒng)降低前列腺癌LNCaP細胞存活率58
• 3.4 靶向系統(tǒng)促進前列腺癌LNCaP細胞凋亡58-60
• 3.5 靶向系統(tǒng)降低PSMA(+)前列腺癌細胞活力60
• 3.6 靶向系統(tǒng)破壞PSMA(+)前列腺癌細胞形態(tài)60-61
• 3.7 靶向系統(tǒng)誘導前列腺癌LNCaP細胞發(fā)生自噬61-62
• 3.8 靶向系統(tǒng)影響LNCaP細胞自噬及凋亡相關蛋白表達62-64
• 4 討論64-66
• 小結66-67
• 參考文獻67-77
• 個人簡歷和研究成果77-78
• 致謝78

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本文編號：900659