本文關(guān)鍵詞：SPC24基因在原發(fā)性肝細(xì)胞癌中的表達(dá)及功能的初步研究

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【摘要】：目的:作為核分裂周期80(nuclear division cycle 80,Ndc80)動(dòng)點(diǎn)蛋白復(fù)合物的核心組分之一,SPC24基因參與并調(diào)控細(xì)胞有絲分裂的重大分子事件,例如:動(dòng)點(diǎn)-微管的精準(zhǔn)耦合、染色體的正確列隊(duì)、染色體的均等分裂等。然而,SPC24基因與原發(fā)性肝細(xì)胞癌(肝癌)(Hepatocellular carcinoma,HCC)發(fā)生、發(fā)展、浸潤(rùn)、轉(zhuǎn)移之間的關(guān)聯(lián)性仍然未知。本文旨在研究SPC24基因在肝癌組織中的表達(dá)水平,并且深入地分析SPC24基因的表達(dá)與肝癌患者臨床病理參數(shù)之間的關(guān)系,為尋找新的肝癌診斷指標(biāo)以及潛在的治療靶點(diǎn)提供可靠的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。方法:1.本研究選取2001年11月至2007年4月期間于桂林醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院行根治性手術(shù)切除的肝癌患者。選取了212例肝癌患者的癌組織及其相應(yīng)的癌旁肝組織樣本(adjacent normal liver tissues,ANLT),9例正常肝組織(選自肝血管瘤患者)樣本。2.首先選用普通RT-PCR方法檢測(cè)20對(duì)肝癌組織和相應(yīng)癌旁組織,以及9例正常肝組織樣本中SPC24 mRNA的表達(dá)情況;進(jìn)一步采用Real-time PCR分析212對(duì)肝癌及相應(yīng)癌旁組織樣本中SPC24 m RNA的表達(dá)水平。3.應(yīng)用免疫組織化學(xué)(Immunohistoehemistry,IHC)方法檢測(cè)69對(duì)肝癌組織和相應(yīng)癌旁組織,以及9例正常肝組織樣本中SPC24蛋白的表達(dá)模式;并且采用Western-blot實(shí)驗(yàn)分析40對(duì)肝癌組織和相應(yīng)癌旁組織,以及9例正常肝組織樣本中SPC24蛋白的表達(dá)水平。4.rt-pcr方法檢測(cè)12種人肝癌細(xì)胞系(hep3b,sk-hep1,huh7,smmc7721,mhcc97l,mhcc97h,plc,hepg2,qgy7703,bel7402,bel7404,bel7405)和1種正常肝細(xì)胞系(lo2)中spc24mrna的表達(dá)水平,篩選出適用于細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)的肝癌細(xì)胞系。5.應(yīng)用whitehead公司的在線設(shè)計(jì)軟件(http://jura.wi.mit.edu/bioc/sirnaext/)設(shè)計(jì)3對(duì)特異性靶向spc24基因的小干擾rna(smallinterferingrna,sirna)序列及1對(duì)陰性對(duì)照序列,并由上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司合成。將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的人肝癌細(xì)胞系smmc7721和hepg2細(xì)胞接種于6孔板,待細(xì)胞融合率達(dá)到60-80%時(shí),將針對(duì)spc24基因的特異性sirna轉(zhuǎn)染至smmc7721和hepg2肝癌細(xì)胞,分別提取轉(zhuǎn)染后48h、72h的細(xì)胞總rna及蛋白。并采用rt-pcr及western-blot實(shí)驗(yàn)技術(shù)檢測(cè)轉(zhuǎn)染效果。6.采用沉默肝癌細(xì)胞內(nèi)源性spc24效果最佳的sirna-2進(jìn)行后序的細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)。spc24sirna-2轉(zhuǎn)染至smmc7721和hepg2肝癌細(xì)胞后,采用細(xì)胞計(jì)數(shù)cck-8試劑盒(cellcountingkit-8,cck-8)分析肝癌細(xì)胞增殖及粘附比例的變化。7.spc24sirna-2轉(zhuǎn)染至smmc7721和hepg2肝癌細(xì)胞后,采用transwell侵襲實(shí)驗(yàn)分析肝癌細(xì)胞侵襲能力的變化。8.spc24sirna-2轉(zhuǎn)染至smmc7721和hepg2肝癌細(xì)胞后,選取western-blot實(shí)驗(yàn)檢測(cè)肝癌細(xì)胞中cleavedcaspase-3表達(dá)量的變化,分析肝癌細(xì)胞凋亡能力的變化。結(jié)果:1.rt-pcr檢測(cè)的20對(duì)樣本中,與相應(yīng)癌旁組織比較,有18例(90%)肝癌樣本中動(dòng)點(diǎn)相關(guān)基因spc24mrna表達(dá)顯著上調(diào),而在9例正常肝組織中spc24mrna表達(dá)量十分微弱。realtimepcr檢測(cè)的212對(duì)樣本中,有155例(73.1%)肝癌樣本中spc24mrna表達(dá)顯著上調(diào),而僅有57例(26.9%)spc24mrna表達(dá)量呈下調(diào)狀態(tài)。肝癌組織中spc24mrna表達(dá)顯著高于對(duì)應(yīng)癌旁組織(mean±sd,1.123±0.072和0.350±0.036,p0.0001)。2.ihc檢測(cè)69對(duì)hcc樣本中spc24蛋白水平情況,結(jié)果顯示:有51例(73.90%)肝癌患者組織中的spc24蛋白水平明顯高于相應(yīng)的癌旁組織,而僅有22例(31.90%)癌旁肝組織中spc24蛋白呈現(xiàn)高表達(dá)水平,同時(shí),在9例正常肝組織中,spc24蛋白水平呈陰性。western-blot檢測(cè)的40對(duì)樣本中spc24蛋白質(zhì)的表達(dá)情況,結(jié)果表明:有35例(87.50%)肝癌患者組織中的spc24蛋白水平明顯高于相對(duì)應(yīng)的癌旁組織,而在9例正常肝組織中,spc24蛋白水平極低,或檢測(cè)不到。3.rt-pcr檢測(cè)結(jié)果顯示:spc24mrna在人肝癌細(xì)胞系hep3b,huh7,smmc7721,mhcc97h,plc,hepg2,qgy7703,bel7404,bel7405中表達(dá)明顯上調(diào),而在lo2,mhcc97l,sk-hep1,bel7402等細(xì)胞系中則表達(dá)相對(duì)較弱。4.rt-pcr和westernblotting檢測(cè)結(jié)果顯示:用針對(duì)spc24基因的特異性sirnas干擾人肝癌細(xì)胞系smmc7721和hepg2后,肝癌細(xì)胞中內(nèi)源性spc24mrna和蛋白質(zhì)表達(dá)水平明顯降低。并且,spc24sirna-2的靶向沉默效果最佳,所以我們選用spc24sirna-2進(jìn)行后序的細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)。5.與sirna陰性對(duì)照組比較,spc24sirna-2顯著抑制人肝癌細(xì)胞系smmc7721和hepg2細(xì)胞的生長(zhǎng)能力、粘附能力、和侵襲能力。westernblot檢測(cè)發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染spc24sirna-2的肝癌細(xì)胞中cleavedcaspase-3表達(dá)量明顯上調(diào),表明沉默肝癌細(xì)胞內(nèi)源性spc24基因后可引發(fā)細(xì)胞凋亡事件。6.相關(guān)性分析結(jié)果顯示:肝癌組織中spc24mrna的高表達(dá)水平與血清甲胎蛋白水平(alpha-fetoprotein,AFP)(200 ng/ml)、較大的腫瘤、多發(fā)腫瘤、以及巴塞羅那臨床肝癌分期(barcelona clinic liver cancer staging classification,BCLC)為B-C期等因素呈正相關(guān)(p0.05)。7.采用Kaplan-Meier曲線評(píng)估,我們發(fā)現(xiàn),與低表達(dá)SPC24的患者比較,高表達(dá)SPC24的患者術(shù)后無(wú)瘤生存時(shí)間(disease-free survival,DFS)(p0.001)和總生存時(shí)間(overall survival,OS)(p=0.001)更短。多因素分析顯示,SPC24表達(dá)上調(diào)可作為預(yù)測(cè)肝癌預(yù)后的獨(dú)立因素。結(jié)論:SPC24在肝癌組織中表達(dá)明顯上調(diào),有可能作為預(yù)測(cè)肝癌病人預(yù)后的新生標(biāo)志物。此外,siRNA沉默SPC24基因后可顯著抑制肝癌細(xì)胞增殖能力,表明SPC24基因可作為治療肝癌的靶向目標(biāo)。
【關(guān)鍵詞】：原發(fā)性肝細(xì)胞癌 SPC24 增殖 侵襲 預(yù)后
【學(xué)位授予單位】：桂林醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類(lèi)號(hào)】：R735.7
【目錄】：

• 中文摘要5-9
• ABSTRACT9-14
• 英漢縮略詞對(duì)照表14-16
• 前言16-18
• 1 材料與方法18-39
• 1.1 主要實(shí)驗(yàn)材料18-19
• 1.2 主要實(shí)驗(yàn)試劑19-22
• 1.3 主要實(shí)驗(yàn)儀器22-23
• 1.4 實(shí)驗(yàn)方法23-39
• 2 結(jié)果39-54
• 2.1 SPC24 m RNA在肝癌組織中表達(dá)上調(diào)39-40
• 2.2 SPC24與肝癌患者血清AFP水平呈正相關(guān)40-41
• 2.3 SPC24蛋白在肝癌組織中表達(dá)上調(diào)41-42
• 2.4 SPC24的表達(dá)水平與肝癌患者的臨床病理參數(shù)呈正相關(guān)42-44
• 2.5 SPC24高表達(dá)、臨床病理參數(shù)與肝癌患者術(shù)后無(wú)瘤生存時(shí)間、總生存時(shí)間之間的關(guān)系44-47
• 2.6 SPC24高表達(dá)與肝癌患者術(shù)后生存時(shí)間的關(guān)系47-48
• 2.7 SPC24表達(dá)水平可作為肝癌亞組患者的預(yù)后因子48-50
• 2.8 RNA干擾內(nèi)源性SPC24基因明顯抑制肝癌細(xì)胞的生長(zhǎng)、粘附以及侵襲能力50
• 2.9 RNA沉默內(nèi)源性SPC24基因可誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞的凋亡50-54
• 3 討論54-56
• 4 結(jié)論56-57
• 參考文獻(xiàn)57-64
• 綜述64-74
• 參考文獻(xiàn)68-74
• 攻讀學(xué)位期間發(fā)表的學(xué)術(shù)論文目錄74
• 攻讀學(xué)位期間參與的科研課題74-75
• 致謝75-76

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本文編號(hào)：894359