本文關(guān)鍵詞：靶向阻斷肝癌細(xì)胞STAT3制備抗腫瘤疫苗及其抗腫瘤機(jī)制探討

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【摘要】：研究目的肝癌是世界最常見的惡性腫瘤之一,無論是發(fā)病率還是致死率均排在前列。我國(guó)是肝癌發(fā)生的重災(zāi)區(qū),約占全世界肝癌發(fā)生率的55%,已經(jīng)成為嚴(yán)重威脅我國(guó)人民健康和生命的重要疾病之一。目前用于肝癌治療的手段主要包括手術(shù)、放療和化療等,但是療效都不理想,副作用明顯,且腫瘤極易復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移,患者預(yù)后較差。近年來,伴隨分子生物技術(shù)和免疫學(xué)的飛速發(fā)展,腫瘤生物治療作為一種安全、有效的治療手段,在腫瘤綜合治療中的作用越來越突出,已逐步發(fā)展為繼手術(shù)、化療和放療之后的第四大治療方法。腫瘤生物治療是一類應(yīng)用細(xì)胞生物學(xué)和分子生物學(xué)手段對(duì)機(jī)體免疫系統(tǒng)或腫瘤的生長(zhǎng)進(jìn)行調(diào)節(jié),從而抑制腫瘤生長(zhǎng)的治療方法。具有特異性強(qiáng)、效果確切、毒副作用低、防止癌癥術(shù)后復(fù)發(fā)效果顯著、遠(yuǎn)期抗癌效果良好等優(yōu)點(diǎn)。近年來,腫瘤生物治療的突破口在于尋找高效、特異性的靶點(diǎn)。STAT3是信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄活化因子家族的重要成員。作為一種轉(zhuǎn)錄因子,STAT3在許多原發(fā)性腫瘤中持續(xù)性激活并過度表達(dá)�；罨腟TAT3不僅能夠通過調(diào)節(jié)其靶基因來促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖、抑制凋亡、影響細(xì)胞周期,而且還能通過調(diào)控腫瘤細(xì)胞分泌細(xì)胞因子促進(jìn)腫瘤血管生成和免疫逃逸。因此,STAT3的異常表達(dá)與腫瘤的發(fā)生發(fā)展有著密切的關(guān)系。我們前期的研究結(jié)果證實(shí),阻斷肝癌細(xì)胞中的STAT3信號(hào)通路可以明顯抑制腫瘤細(xì)胞的增殖、促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡。更為重要的是,阻斷STAT3以后,肝癌細(xì)胞對(duì)NK細(xì)胞的殺傷敏感性明顯增強(qiáng),且阻斷STAT3的肝癌細(xì)胞可以有效激活小鼠機(jī)體免疫系統(tǒng)對(duì)HCC的免疫應(yīng)答,打破免疫耐受,產(chǎn)生有效的抗腫瘤效應(yīng)。這一結(jié)果提示我們,阻斷STAT3信號(hào)通路后,肝癌細(xì)胞的腫瘤抗原成分可能發(fā)生了改變,導(dǎo)致其免疫原性增強(qiáng)。因此,本研究中我們利用基因誘騙(decoy-ODN)的方法阻斷肝癌細(xì)胞中的STAT3信號(hào)通路,并通過反復(fù)凍融將其制備成腫瘤疫苗。在確定該疫苗的預(yù)防效果后,系統(tǒng)分析了其抗腫瘤機(jī)制。結(jié)果證明,連續(xù)免疫接種疫苗三次后的小鼠能夠產(chǎn)生很好的免疫記憶,當(dāng)再次接種腫瘤細(xì)胞時(shí),能夠產(chǎn)生有效的抗腫瘤免疫應(yīng)答,抑制腫瘤的發(fā)生和發(fā)展,延長(zhǎng)小鼠生存期。對(duì)其抗腫瘤的機(jī)制研究發(fā)現(xiàn),腫瘤疫苗能夠增加機(jī)體T細(xì)胞和NK細(xì)胞的比例及活化水平,促進(jìn)DC細(xì)胞的成熟與活化,誘導(dǎo)Thl型細(xì)胞因子的表達(dá),誘導(dǎo)記憶性T淋巴細(xì)胞的產(chǎn)生,并抑制機(jī)體的免疫負(fù)調(diào)性細(xì)胞和分子。該研究為臨床預(yù)防及治療腫瘤提供了新的方法及實(shí)驗(yàn)依據(jù)。研究方法1.以不同濃度的FITC標(biāo)記的Decoy-ODN對(duì)小鼠肝癌細(xì)胞H22和Hepal-6進(jìn)行轉(zhuǎn)染,通過流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)轉(zhuǎn)染效率,確定實(shí)驗(yàn)轉(zhuǎn)染的最適條件。在該條件下對(duì)肝癌細(xì)胞轉(zhuǎn)染Decoy-ODN后,通過Annexin-V/PI雙染色法檢測(cè)腫瘤細(xì)胞的凋亡情況,驗(yàn)證Decoy-ODN在小鼠肝癌細(xì)胞中的效應(yīng)。2.小鼠肝癌細(xì)胞轉(zhuǎn)染Decoy-ODN后,通過液氮反復(fù)凍融的方法將其制備成腫瘤疫苗。以H22細(xì)胞疫苗和Hepal-6細(xì)胞疫苗分別對(duì)BALB/c和C57BL/6兩種小鼠模型連續(xù)免疫三次后進(jìn)行荷瘤,觀察小鼠腫瘤生長(zhǎng)情況以及生存期。3.疫苗對(duì)小鼠免疫三次以后,分離小鼠各組織淋巴細(xì)胞,通過流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)淋巴細(xì)胞各個(gè)亞群的比例和活化情況、分泌腫瘤免疫相關(guān)細(xì)胞因子的含量以及抗原遞呈細(xì)胞DC的比例及其共刺激分子的表達(dá)。以此探討免疫系統(tǒng)的活化狀態(tài)和激活免疫反應(yīng)的機(jī)制。4.疫苗對(duì)小鼠免疫三次后,分離小鼠各組織淋巴細(xì)胞,檢測(cè)小鼠體內(nèi)免疫記憶性淋巴細(xì)胞的比例,探討疫苗的免疫記憶功能。并且通過體外誘導(dǎo)增殖實(shí)驗(yàn)來驗(yàn)證免疫記憶效果。5.疫苗免疫后荷瘤的小鼠,分離各個(gè)組織淋巴細(xì)胞,通過流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)各淋巴細(xì)胞亞群的活化狀態(tài),以及免疫負(fù)調(diào)細(xì)胞的比例及其分泌的免疫抑制性細(xì)胞因子的含量,以此探討機(jī)體抗腫瘤免疫的機(jī)制。6.通過無胸腺裸鼠進(jìn)行疫苗免疫實(shí)驗(yàn),觀察荷瘤裸鼠腫瘤的生長(zhǎng)情況以及機(jī)體免疫系統(tǒng)活化的水平,探討發(fā)揮免疫記憶功能以及抗腫瘤效應(yīng)的細(xì)胞亞群。7.以荷瘤小鼠的血清孵育腫瘤細(xì)胞,通過流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)腫瘤細(xì)胞表面腫瘤特異性IgG的含量,探討體液免疫在腫瘤清除過程中的作用。研究結(jié)果1.以100nM濃度的ODN轉(zhuǎn)染小鼠肝癌細(xì)胞12h,Decoy-ODN可以有效進(jìn)入肝癌細(xì)胞,并促進(jìn)細(xì)胞凋亡,證明以此轉(zhuǎn)染條件處理小鼠腫瘤細(xì)胞,Decoy-ODN可以發(fā)揮阻斷STAT3的作用。2.經(jīng)腫瘤疫苗免疫的小鼠,對(duì)其進(jìn)行HCC荷瘤,發(fā)現(xiàn)其成瘤率明顯降低,并且腫瘤的生長(zhǎng)速度顯著減緩,生存期延長(zhǎng)。3.經(jīng)疫苗免疫后,小鼠外周血T細(xì)胞和NK細(xì)胞的比例明顯高于對(duì)照組,并且其活化性標(biāo)志CD69的表達(dá)水平顯著提高,CD4+和CD8+T細(xì)胞胞內(nèi)IFN-γ和[NF-α的分泌量明顯增加。進(jìn)一步分析抗原遞呈細(xì)胞DC的變化發(fā)現(xiàn),DC細(xì)胞的比例以及其共刺激分子CD80和CD86的表達(dá)均顯著高于對(duì)照組。4.通過疫苗免疫后,小鼠外周血中記憶性T細(xì)胞(CD3+CD44+CD62L+)的比例明顯高于對(duì)照組。進(jìn)一步分離免疫后的小鼠的脾臟淋巴細(xì)胞,在體外利用滅活的腫瘤細(xì)胞進(jìn)行刺激,發(fā)現(xiàn)處理5天后,疫苗免疫組的脾臟淋巴細(xì)胞增殖顯著增加。5.小鼠經(jīng)過疫苗免疫后荷瘤,其外周血以及腫瘤浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞中T細(xì)胞的比例和CD69+T比例均顯著高于對(duì)照組,并且T細(xì)胞表面脫顆粒相關(guān)分子CD107a的陽性率也顯著增加。雖然NK細(xì)胞比列沒有顯著變化,但是其CD69和CD107a表達(dá)水平均明顯升高。通過分析免疫負(fù)調(diào)細(xì)胞Treg的比例及其分泌的抑制性細(xì)胞因子的含量發(fā)現(xiàn),疫苗免疫的小鼠荷瘤后其外周血中Treg細(xì)胞的比例明顯下降,且血清中IL-10和TGF-β的含量明顯降低。6.裸鼠經(jīng)疫苗免疫后荷瘤,其腫瘤生長(zhǎng)速度與未免疫組相比無明顯差別,體內(nèi)淋巴細(xì)胞的活化也沒有顯著變化。7.血清孵育腫瘤細(xì)胞后,用anti mouse IgG抗體通過流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè),發(fā)現(xiàn)IgG+的腫瘤細(xì)胞比例明顯升高,表明經(jīng)疫苗免疫后小鼠血清中腫瘤特異性的IgG含量明顯升高了。結(jié)論及意義本課題通過基因誘騙的手段靶向阻斷肝癌細(xì)胞的STAT3信號(hào)通路,然后將全細(xì)胞進(jìn)行滅活,制備腫瘤疫苗并對(duì)小鼠進(jìn)行免疫。結(jié)果發(fā)現(xiàn),通過疫苗免疫后,小鼠的免疫系統(tǒng)明顯活化,并且產(chǎn)生免疫記憶性。對(duì)經(jīng)疫苗免疫的小鼠進(jìn)行荷瘤,發(fā)現(xiàn)小鼠的成瘤率以及腫瘤生長(zhǎng)速度明顯降低,小鼠生存期延長(zhǎng)。進(jìn)一步對(duì)疫苗的抗腫瘤機(jī)制研究發(fā)現(xiàn),其抗腫瘤作用是依賴T細(xì)胞的,并且體液免疫在其中也起到了一定的作用。該研究為臨床預(yù)防和治療腫瘤提供了新的策略和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
【關(guān)鍵詞】：肝癌 STAT3 腫瘤疫苗 Decoy
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R735.7
【目錄】：

• 中文摘要8-12
• Abstract12-17
• 主要符號(hào)說明17-19
• 第一部分 文獻(xiàn)綜述19-42
• 一、腫瘤與免疫19-25
• 1. 腫瘤免疫反應(yīng)的特征19-22
• 2. 腫瘤免疫逃逸的機(jī)制22-25
• 二、腫瘤免疫治療策略25-32
• 1. 主動(dòng)免疫治療27-29
• 2. 被動(dòng)免疫治療29-32
• 小結(jié)32-33
• 參考文獻(xiàn)33-42
• 第二部分 靶向阻斷肝癌細(xì)胞STAT3制備腫瘤疫苗并探討其抗腫瘤機(jī)制42-87
• 1. 前言42-43
• 2. 材料和方法43-56
• 2.1 實(shí)驗(yàn)材料及配置43-47
• 2.2 主要實(shí)驗(yàn)儀器47-48
• 2.3 主要實(shí)驗(yàn)方法48-56
• 3. 實(shí)驗(yàn)結(jié)果56-76
• 3.1 Decoy-ODN阻斷STAT3可以誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡56-59
• 3.1.1 STAT3 Decoy-ODN的設(shè)計(jì)合成56
• 3.1.2 Decoy-ODN可以有效轉(zhuǎn)染入肝癌細(xì)胞中56-58
• 3.1.3 Decoy-ODN轉(zhuǎn)入肝癌細(xì)胞中能夠有效促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡58-59
• 3.2 阻斷STAT3的肝癌細(xì)胞疫苗免疫小鼠能夠抑制小鼠腫瘤的發(fā)生和發(fā)展59-60
• 3.2.1 腫瘤疫苗的制備和小鼠免疫方案59
• 3.2.2 腫瘤疫苗免疫能夠預(yù)防腫瘤的發(fā)生和發(fā)展59-60
• 3.3 阻斷STAT3的肝癌細(xì)胞疫苗能夠激活機(jī)體免疫系統(tǒng)的活化60-65
• 3.3.1 腫瘤疫苗能夠增加機(jī)體T淋巴細(xì)胞和NK細(xì)胞的比例61-62
• 3.3.2 腫瘤疫苗能夠誘導(dǎo)機(jī)體T淋巴細(xì)胞和NK細(xì)胞的活化62-63
• 3.3.3 腫瘤疫苗能夠誘導(dǎo)機(jī)體DC細(xì)胞的活化63-64
• 3.3.4 腫瘤疫苗能夠誘導(dǎo)T淋巴細(xì)胞Thl型細(xì)胞因子的表達(dá)64-65
• 3.4 阻斷STAT3的肝癌細(xì)胞疫苗能夠誘導(dǎo)免疫記憶的產(chǎn)生65-73
• 3.4.1 腫瘤疫苗能夠誘導(dǎo)機(jī)體免疫記憶性T淋巴細(xì)胞的產(chǎn)生66-68
• 3.4.2 腫瘤疫苗免疫后能夠誘導(dǎo)免疫系統(tǒng)對(duì)腫瘤細(xì)胞的再次免疫應(yīng)答68-71
• 3.4.3 腫瘤疫苗免疫后機(jī)體免疫系統(tǒng)活化依賴DC細(xì)胞的活化71
• 3.4.4 腫瘤疫苗免疫后能夠能夠抑制機(jī)體的免疫負(fù)調(diào)細(xì)胞和分子71-73
• 3.5 疫苗誘導(dǎo)產(chǎn)生的抗腫瘤效應(yīng)依賴細(xì)胞免疫和體液免疫73-76
• 3.5.1 疫苗產(chǎn)生的抗腫瘤效應(yīng)依賴T淋巴細(xì)胞73-74
• 3.5.2 腫瘤特異性抗體發(fā)揮抗腫瘤作用74-76
• 4. 討論76-79
• 參考文獻(xiàn)79-87
• 文章創(chuàng)新點(diǎn)及意義87-88
• 致謝88-89
• 攻讀學(xué)位期間取得的成果89-90
• 已發(fā)表論文90-105
• 學(xué)位論文評(píng)閱及答辯情況表105

【參考文獻(xiàn)】

中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫 前2條

1 王慧;潘科;夏建川;;IDO和CD4~+ CD25~+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞在腫瘤免疫逃逸中相互作用的研究進(jìn)展[J];癌癥;2009年02期

2 陳杰,曹澤毅,張平,彭芝蘭,楊延林,畢建宏;經(jīng)腹膜外盆腔淋巴間隙給予IL-2對(duì)婦科腫瘤患者TIL亞群及NK細(xì)胞的影響[J];四川大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版);2004年03期

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本文編號(hào)：892161