本文關(guān)鍵詞：肝靶向肽CSP I-plus修飾的重組人內(nèi)皮抑素對HepG2肝癌細(xì)胞的作用研究

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【摘要】：肝細(xì)胞性肝癌(Hepatocellular carcinoma,HCC)的發(fā)生是一個多因素多階段的復(fù)雜過程,迄今沒有有效的根治辦法。尋求新的治療方法和治療新靶標(biāo)是目前肝細(xì)胞性肝癌治療的迫切需求。目前國內(nèi)外研究一直致力于通過阻斷腫瘤新生血管形成來達(dá)到治療腫瘤的目的。血管生成抑制劑,特別是多肽或內(nèi)源性肽可能成為異常血管生成依賴性疾病最安全最低毒的治療措施。內(nèi)皮抑制素(endostatin)是膠原蛋白XVIII羧基末端水解而來的20 k Da多肽片段,是一種內(nèi)源性血管形成抑制因子,特異性地抑制內(nèi)皮細(xì)胞增生和遷移,對血管形成及腫瘤生長具有明顯抑制作用。此外研究證實(shí)內(nèi)皮抑素對乳腺癌、大腸癌等腫瘤細(xì)胞也具有直接的抑制作用。但正如許多血管生成抑制劑一樣,內(nèi)皮抑素單一給藥并不能獲得顯著地療效,加之蛋白制劑存在的問題從而使美國于2003年終止對內(nèi)皮抑素的臨床開發(fā)。近年來靶向制劑的研究儼然已經(jīng)成為國內(nèi)外藥劑研究的熱點(diǎn)之一。CSP I-plus是從瘧原蟲環(huán)子孢子蛋白(Circumsprozoite protein,CSP)中篩選得到的能夠特異識別并黏附在肝細(xì)胞表面的多肽序列。利用CSP I-plus的這一特性,本實(shí)驗室采用基因工程技術(shù)和原核表達(dá)系統(tǒng)成功制備新型肝靶向人內(nèi)皮抑素r ES-CSP。目前,該融合蛋白對內(nèi)皮細(xì)胞的抑制作用以及肝靶向性已經(jīng)得到證實(shí),但對肝癌細(xì)胞的作用尚無研究報道,有待進(jìn)一步探討。本論文意在進(jìn)一步從體內(nèi)原位肝癌模型驗證rES-CSP肝靶向性的基礎(chǔ)上,采用Hep G2細(xì)胞和裸鼠原位肝癌模型從細(xì)胞和動物整體水平評價其抗肝癌效果并初步探討凋亡相關(guān)的分子機(jī)制。研究目的本論文通過研究新型肝靶向人內(nèi)皮抑素r ES-CSP對肝癌細(xì)胞的直接抑制作用,為r ES-CSP抑制肝癌生長的作用靶點(diǎn)進(jìn)行了補(bǔ)充,從而為肝癌靶向治療提供新的科學(xué)依據(jù)和藥物開發(fā)思路。研究方法1.探討r ES-CSP的肝靶向性1.1 r ES-CSP的裸鼠體內(nèi)分布實(shí)驗:建立裸鼠肝癌皮下移植瘤模型,通過瘤塊種植法法建立肝原位移植瘤模型。將裸鼠隨機(jī)分為空白對照(生理鹽水)組,重組人血管內(nèi)皮抑素(r Endostatin)組,融合蛋白(r ES-CSP)組。建模1月后單次尾靜脈給藥,分別于5、30和60 min取血后處死動物,取心、肝、脾、肺、腎、腫瘤組織制備勻漿,ELISA方法測定各樣品中內(nèi)皮抑素濃度。2.探討r ES-CSP的體外抗HCC作用及凋亡相關(guān)分子機(jī)制2.1 MTS方法分別檢測給予終濃度為12μM、6μM、1.2μM、0.6μM、0.06μM的重組人血管內(nèi)皮抑制素、CSP I-plus和肝靶向人內(nèi)皮抑素r ES-CSP作用24 h和48 h后對Hep G2、Chang’s和A549細(xì)胞的毒性作用,以選擇合適的藥物濃度進(jìn)行后續(xù)的活性研究。其后,分別從遷移分析、流式細(xì)胞術(shù)和透射電鏡來考察r ES-CSP抗肝癌細(xì)胞遷移及對細(xì)胞周期和凋亡的影響。2.2 Western Blot檢測r ES-CSP誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡的相關(guān)分子機(jī)制,分別給予終濃度為0.6μM、6μM的重組人內(nèi)皮抑制素和肝靶向人內(nèi)皮抑素r ES-CSP作用24 h后收集細(xì)胞并裂解,提取蛋白后分別與凋亡蛋白Caspase 8抗體、凋亡抑制蛋白Bcl-2抗體進(jìn)行免疫印跡實(shí)驗,檢測并分析細(xì)胞內(nèi)Caspase 8和Bcl-2的表達(dá)變化。3.探討r ES-CSP的體內(nèi)抗HCC作用3.1建立肝原位移植瘤模型,實(shí)驗動物隨機(jī)分為3組,每組10只:①空白組(生理鹽水),②r Endostatin(6μM)組,③r ES-CSP(6μM)組。建模1周后隔天靜脈給藥,連續(xù)用藥30天。處死動物,觀察肝臟腫瘤生長情況,剝離肝組織中的瘤塊稱瘤重,計算抑瘤率;3.2取肝癌組織做石蠟切片,HE染色觀察組織的病理學(xué)改變。免疫組化比較肝癌組織中CD31的表達(dá)變化。4.數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析:實(shí)驗數(shù)據(jù)均以均數(shù)與標(biāo)準(zhǔn)差(sx±)表示,應(yīng)用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件分析處理實(shí)驗數(shù)據(jù)。采用單因素方差分析(one-way ANOVA),方差齊時多重比較采用LSD法;方差不齊時,多重比較采用Dunnett T 3法。P㩳0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。實(shí)驗結(jié)果1.探討r ES-CSP的肝靶向性:1.1肝原位種植瘤模型制備:取人肝癌細(xì)胞系Hep G2制備皮下移植瘤,后將腫瘤組織接種于裸鼠肝內(nèi),建立裸鼠肝原位移植瘤模型。1.2 r ES-CSP的裸鼠體內(nèi)分布實(shí)驗:荷肝癌原位裸鼠尾靜脈給藥,ELISA方法測定給藥后5、30和60 min時裸鼠的心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟、腫瘤組織和血液中內(nèi)皮抑素濃度,結(jié)果顯示肝靶向內(nèi)皮抑素與普通重組人內(nèi)皮抑素組相比,各臟器內(nèi)皮抑素濃度均有顯著性差異(P㩳0.05);各時間點(diǎn)肝靶向人內(nèi)皮抑素r ES-CSP組肝臟及肝癌組織內(nèi)皮抑素濃度均高于普通內(nèi)皮抑素組(P㩳0.01)。2.探討r ES-CSP的體外抗HCC作用及凋亡相關(guān)分子機(jī)制2.1細(xì)胞毒性實(shí)驗:MTS結(jié)果顯示r ES-CSP對Hep G2細(xì)胞的增殖有抑制作用,且呈時間和劑量的依賴性。而CSP I-plus、r Endostatin均對肝癌細(xì)胞的增殖幾乎無影響。同時在低濃度時,r ES-CSP對肝癌細(xì)胞的抑制作用明顯高于Chang’s和A549細(xì)胞(P㩳0.01)。在6μM時,Hep G2細(xì)胞的存活率為46.3±2.31%,Chang’s和A549細(xì)胞的存活率分別為92.8±2.11%、93.2±2.96%。2.2細(xì)胞遷移實(shí)驗:隨著時間的推移,r ES-CSP組能顯著抑制肝癌細(xì)胞劃痕的愈合,與重組人內(nèi)皮抑素組相比,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P㩳0.05)。同時Transwell小室實(shí)驗顯示,與空白對照組相比,經(jīng)6μM r Endostatin或r ES-CSP處理后的肝癌細(xì)胞遷移到下室的數(shù)量明顯減少(P值均㩳0.05),遷移抑制率分別為27±1.75%、65.5±2.95%。2.3流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞周期和凋亡:結(jié)果顯示,6μM r Endostatin作用24 h和48 h后,肝癌細(xì)胞的周期分布和凋亡幾乎不受影響(P0.05)。而r ES-CSP顯著誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞G2/M期細(xì)胞數(shù)目增加同時伴隨著G0/G1和S期細(xì)胞減少(P㩳0.01),同時肝癌細(xì)胞的早期凋亡率、晚期凋亡率和總凋亡率顯著高于對照組細(xì)胞(P㩳0.01)。2.4透射電鏡觀察細(xì)胞的凋亡:結(jié)果顯示r ES-CSP處理后,肝癌細(xì)胞多出現(xiàn)中晚期凋亡,可見細(xì)胞膜出芽,凋亡小體形成,內(nèi)含有退變的細(xì)胞器。核碎裂,核固縮,胞核染色質(zhì)邊集、成碎塊狀,核膜消失。2.5 Western blot檢測凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)變化:r ES-CSP可顯著降低Bcl-2蛋白表達(dá)水平,同時可能上調(diào)Caspase 8蛋白的表達(dá)。r Endostatin處理組對Bcl-2和Caspase8兩種蛋白的表達(dá)影響不明顯。3.探討r ES-CSP的體內(nèi)抗HCC作用及相關(guān)分子表達(dá)變化3.1體內(nèi)對裸鼠肝癌原位移植瘤的抑制作用:r ES-CSP組與重組人血管內(nèi)皮抑素組、對照組相比,瘤重和瘤體積均有顯著性差異(P0.05),結(jié)果表明r ES-CSP能顯著抑制人肝癌裸鼠原位移植瘤的生長,重組人內(nèi)皮抑素對肝癌的生長抑制作用不明顯;r ES-CSP和r Endostatin組的人肝癌裸鼠荷瘤的抑瘤率為29.6±4.39%和5.30±1.23%。3.2 HE染色觀察組織的病理變化:肝癌細(xì)胞呈浸潤性生長,r ES-CSP組同實(shí)驗對照組相比,r ES-CSP組癌組織多發(fā)生壞死,間質(zhì)血管少于對照組,癌細(xì)胞核分裂相對減少,可見有大量白細(xì)胞和淋巴細(xì)胞浸潤,表明r ES-CSP組對癌細(xì)胞生長有一定的抑制作用。然而部分肺病理切片觀察可見肺泡間隔增厚,肺泡壁和細(xì)支氣管壁有較多炎性細(xì)胞浸潤,顯示出較重的間質(zhì)性肺炎病變。3.3免疫組織化學(xué)檢測肝癌組織中微血管密度和凋亡抑制蛋白Bcl-2的表達(dá)變化:與對照組相比,r Endostatin組和r ES-CSP組腫瘤組織微血管密度相對減小,兩組間差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。結(jié)論肝靶向肽CSP I-plus修飾的重組人內(nèi)皮抑素能靶向結(jié)合于肝細(xì)胞表面分子HSPG,從而在肝臟組織得到明顯富集。體外抗HCC活性實(shí)驗證實(shí)r ES-CSP可顯著抑制肝癌細(xì)胞的增殖和遷移,阻滯細(xì)胞的復(fù)制周期,并且增加肝癌細(xì)胞的凋亡率。動物實(shí)驗證實(shí),r ES-CSP能夠顯著抑制裸鼠原位肝癌的生長,作用效果顯著強(qiáng)于重組人血管內(nèi)皮抑制素,并且肝癌組織CD31蛋白表達(dá)下調(diào)與重組人血管內(nèi)皮抑制素組相比具有顯著差異。綜上所述,肝靶向肽CSP I-plus修飾的重組人內(nèi)皮抑素能在肝臟組織富集,從而提高內(nèi)皮抑素對肝癌細(xì)胞的靶向抑制作用,為肝癌的靶向治療提供新的科學(xué)依據(jù)與藥物開發(fā)依據(jù)。
【關(guān)鍵詞】：重組人血管內(nèi)皮抑制素 肝靶向肽 融合蛋白 肝細(xì)胞性肝癌
【學(xué)位授予單位】：廣東藥學(xué)院
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R735.7
【目錄】：

• 摘要5-9
• Abstract9-14
• 第一章 序言14-21
• 1.1 研究背景14-19
• 1.2 研究思路19-21
• 第二章 rES-CSP的肝靶向作用研究21-30
• 2.1 前言21-22
• 2.2 實(shí)驗材料22-23
• 2.3 實(shí)驗方法23-25
• 2.3.1 細(xì)胞復(fù)蘇和培養(yǎng)23-24
• 2.3.2 肝原位種植瘤模型制備24
• 2.3.3 rES-CSP裸鼠體內(nèi)分布實(shí)驗24-25
• 2.3.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析25
• 2.4 實(shí)驗結(jié)果25-28
• 2.4.1 人肝癌裸鼠原位移植瘤模型建立成功25-26
• 2.4.2 ELISA檢測rES-CSP在裸鼠體內(nèi)的組織分布26-28
• 2.5 討論28-30
• 第三章 rES-CSP的體外抗HCC作用研究30-48
• 3.1 前言30
• 3.2 實(shí)驗材料30-32
• 3.3 實(shí)驗方法32-37
• 3.3.1 細(xì)胞毒性實(shí)驗32-33
• 3.3.2 細(xì)胞遷移實(shí)驗33-34
• 3.3.3 細(xì)胞周期和凋亡實(shí)驗34-35
• 3.3.4 Western Blot檢測細(xì)胞中凋亡蛋白的表達(dá)35-37
• 3.4 實(shí)驗結(jié)果37-46
• 3.4.1 rES-CSP對肝癌細(xì)胞的毒性作用37-40
• 3.4.2 rES-CSP對肝癌細(xì)胞遷移的作用40-42
• 3.4.3 rES-CSP對肝癌細(xì)胞周期分布的影響42-44
• 3.4.4 rES-CSP對肝癌細(xì)胞凋亡的影響44-45
• 3.4.5 透射電鏡觀察細(xì)胞的凋亡45
• 3.4.6 rES-CSP對Hep G2刺激后Bcl-2、Caspase 8 表達(dá)的影響45-46
• 3.5 討論46-48
• 第四章 rES-CSP的體內(nèi)抗HCC作用研究48-60
• 4.1 前言48
• 4.2 實(shí)驗材料48-49
• 4.3 實(shí)驗方法49-52
• 4.3.1 實(shí)驗動物分組及給藥49-50
• 4.3.2 裸鼠體內(nèi)抑瘤實(shí)驗50
• 4.3.3 組織取材及病理切片制作50
• 4.3.4 HE染色50-51
• 4.3.5 免疫組化51-52
• 4.4 實(shí)驗結(jié)果52-58
• 4.4.1 rES-CSP對裸鼠肝癌原位移植瘤的抑制作用52-53
• 4.4.2 HE染色觀察組織的病理變化53-57
• 4.4.3 rES-CSP對裸鼠肝癌原位移植瘤血管密度的抑制作用57-58
• 4.5 討論58-60
• 全文總結(jié)60-61
• 研究展望61-62
• 參考文獻(xiàn)62-68
• 附錄一 攻讀學(xué)位期間科研情況及所受獎勵68-69
• 附錄二 英文縮寫語中文對照69-70
• 文獻(xiàn)綜述70-78
• 參考文獻(xiàn)75-78
• 致謝78

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：891741