發(fā)布時間：2017-09-21 01:38

  本文關鍵詞：Celecoxib阻斷肺癌血管擬態(tài)的機制研究

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【摘要】：研究背景及目的:肺癌是人類發(fā)病率和死亡率最高的惡性腫瘤,非小細胞肺癌(NSCLC)是其最主要的病理類型。超過40%的NSCLC患者初診即為進展期,不適于手術治療。盡管放化療、靶向治療和免疫治療等治療手段已取得重要進展,但是肺癌復發(fā)與轉移仍然是治療的瓶頸,尋找新療法阻斷肺癌復發(fā)和轉移已成為當前的迫切需求。腫瘤血管形成是腫瘤生長、侵襲和轉移的關鍵因素,血管擬態(tài)是肺癌血管形成的重要形式。血管擬態(tài)是由高侵襲性腫瘤細胞模擬內皮細胞形成功能性血管樣結構的形式,近年來,已被報道與肺癌抗血管藥物耐藥性、肺癌患者不良預后密切相關。然而,血管擬態(tài)的調控機制尚不清楚,針對血管擬態(tài)的特異性阻斷方法更是缺乏。因此,探索肺癌細胞血管擬態(tài)的分子機制及拮抗手段,對于防治肺癌細胞生長、復發(fā)和轉移從而改善患者預后具有重要的理論價值和實踐意義。Celecoxib是一種環(huán)氧化酶2(COX-2)選擇性抑制劑,具有抗炎、抗腫瘤生長、抑制血管新生、以及增敏放化療的作用。我們嘗試使用Celecoxib抑制肺癌細胞血管擬態(tài),發(fā)現(xiàn)Celecoxib能夠抑制肺癌血管擬態(tài),并與COX-2表達無直接關系,可能存在其他的作用靶點。近年研究也顯示,Celecoxib的抗腫瘤作用可不依賴于COX-2,存在脫靶效應(off-target effect)。我們推測,Celecoxib可能作用于COX-2以外的分子靶點,從而阻斷肺癌血管擬態(tài)。研究方法:1.Celecoxib對肺癌細胞血管擬態(tài)的作用選取3株肺癌細胞株(A549、H1650和H460),在三維Matrigel基質膠中觀察肺癌細胞形成管狀結構的情況,PAS染色驗證其血管擬態(tài)(vasculogenic mimicry,VM)特征;5Gy放射線作用于肺癌細胞株,觀察其在Matrigel基質膠中的管狀結構形成能力;在培養(yǎng)基中加入一定濃度的環(huán)氧合酶(COX-2)抑制劑Celecoxib,24小時后,重復Matrigel基質膠成管實驗,探討Celecoxib對肺癌細胞血管擬態(tài)的影響。2.生物信息學方法預測Celecoxib的新靶點選取Qiagen公司的血管新生基因芯片數(shù)據(jù)庫,包括84個參與血管新生的關鍵基因,將這些血管新生相關蛋白作為Celecoxib新靶點分析的分子庫。在Uni Prot和PDB數(shù)據(jù)庫中檢索并篩選蛋白3D結構,在Pub Chem數(shù)據(jù)庫中下載Celecoxib結構。用MGLTools 1.5.6軟件處理受體蛋白與配體小分子結構,保存為pdbqt文件。以蛋白中心某個原子為中心設置對接盒子,用Autodock_vina 1.1.2作為分子對接工具,計算Celecoxib與每個蛋白受體的結合位點和親和力,搜索前20個最佳結合位點。用PLIP計算結合位點與Celecoxib相互作用的殘基詳情。選取親和力高的蛋白比較其與已知抑制劑結合位點以及與Celecoxib的結合位點,證實配受體間是否有功能性結合。3.Celecoxib新靶點的初步驗證將生物信息學方法預測出的與Celecoxib功能性結合的潛在新靶點,包括APN、AKT1、ITAV(基因為ITGAV)和NOS3,進行實驗驗證。由于未能購買到NOS3抗體,我們以APN、AKT1、ITAV為研究對象,并將COX-2作為對照分子。(1)利用熒光光譜技術,將Celecoxib與4種蛋白(APN、AKT1、ITAV、COX-2)混合,用多功能酶標儀測定混合物的同步熒光光譜及其在不同溫度(25°C、29°C、32°C)下的熒光猝滅光譜,通過熒光猝滅特征,推斷Celecoxib與蛋白的直接結合能力。(2)在3株肺癌細胞株(A549、H1650和H460)中,檢測APN、AKT1、ITAV、COX-2的表達差異;在5Gy放射線作用下,檢測三株肺癌細胞中APN、AKT1、ITAV、COX-2表達變化;在Celecoxib作用下,檢測三株肺癌細胞中APN、AKT1、ITAV、COX-2表達變化。(3)選用5周齡雌性BALB/c裸小鼠,將肺癌細胞株經(jīng)皮下注射,建立肺癌移植瘤小鼠模型,隨機分為4組(親本細胞對照組、Celecoxib組、放射治療組、放射治療+Celecoxib組);放射線處理為腫瘤局部給予15Gy X線(320KV)照射,Celecoxib處理為灌胃給予Celecoxib。切除腫瘤組織,經(jīng)免疫熒光雙染(m CD31和h E-cad)和PAS染色觀察血管擬態(tài)形成情況。研究結果:1.Celecoxib抑制肺癌血管擬態(tài)不同肺癌細胞株(A549、H1650和H460)在Matrigel基質膠中均能形成管狀結構,PAS染色呈陽性,顯示其具有血管擬態(tài)特征;在5Gy劑量放射線作用下,肺癌細胞血管擬態(tài)形成能力顯著增強(P0.01);在Celecoxib作用下,血管擬態(tài)完全消失。而該現(xiàn)象與COX-2的表達關系不密切。2.Celecoxib與4種血管新生蛋白有功能性結合84個血管新生蛋白數(shù)據(jù)庫中,54個蛋白具有明確的3D結構。與Celecoxib進行分子對接,結果顯示,14個蛋白與Celecoxib結合自由能低于-8.0 kcal/mol,具有較高親和力;6個蛋白結合自由能低于-9.0 kcal/mol,具有高親和力;1個蛋白結合自由能低于-10.0 kcal/mol,具有更高親和力。進一步分析Celecoxib與潛在靶蛋白及其抑制劑的結合能,模擬比較結合位點,結果顯示Celecoxib與4個蛋白(APN、AKT1、ITAV、NOS3)存在功能性結合,也包括COX-2。3.Celecoxib作用于3個血管新生新靶點熒光光譜分析顯示,隨著Celecoxib濃度升高,其與3種蛋白(AKT1、ITAV和COX-2)混合物的熒光強度逐漸減弱;隨著溫度升高,混合物熒光強度逐漸增強,表明Celecoxib與3種蛋白(AKT1、ITAV和COX-2)均有直接相互作用。隨著培養(yǎng)基中Celecoxib濃度的增加,4種基因(APN、AKT1、IGTAV和COX-2)表達均受到Celecoxib的抑制;不同細胞株中,放射線誘導不同基因(APN、AKT1、IGTAV)的表達上調,Celecoxib可顯著抑制APN、AKT1和IGTAV的表達。動物實驗顯示,移植瘤組織中血管結構顯示為小鼠血管內皮顯色(m CD31陽性)和人肺癌細胞顯色(h E-cad陽性),存在血管擬態(tài)(嵌合血管);放射線可增強該效應,而Celecoxib可阻斷該效應。結論:1.肺癌細胞具有血管擬態(tài)特性,放射線可增強該效應,而Celecoxib可阻斷該效應,其阻斷作用與COX-2表達水平關系不密切。2.除COX-2之外,Celecoxib可不同程度地直接作用于3個血管新生蛋白(APN、AKT1、ITAV),是一種非COX-2依賴的脫靶效應。3.不同肺癌細胞株中,放射線可不同程度誘導APN、AKT1、ITAV的表達,Celecoxib可阻斷肺癌細胞血管擬態(tài),增強肺癌放射線敏感性,是Celecoxib抗腫瘤效應的新發(fā)現(xiàn)。4.通過分子擬合方法,預測Celecoxib“脫靶效應”的血管新生分子靶點,并在體內外實驗中進行證實,具有重要的理論價值,具有“老藥新用”的應用前景。
【關鍵詞】：肺癌 Celecoxib 血管擬態(tài) 脫靶效應
【學位授予單位】：第三軍醫(yī)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R734.2
【目錄】：

• 縮略語表4-5
• 英文摘要5-9
• 中文摘要9-12
• 第一章 前言12-20
• 1.1 選題緣由12-13
• 1.2 研究背景13-19
• 1.3 研究方法19-20
• 第二章 Celecoxib阻斷肺癌血管擬態(tài)20-33
• 2.1 材料與方法20-25
• 2.2 實驗結果25-31
• 2.3 討論31-33
• 第三章 Celecoxib重定位和COX-2 非依賴靶點篩查33-47
• 3.1 軟件與方法33-34
• 3.2 實驗結果34-45
• 3.3 討論45-47
• 第四章 Celecoxib新靶點的初步驗證47-64
• 4.1 材料與方法47-52
• 4.2 實驗結果52-61
• 4.3 討論61-64
• 全文結論64-65
• 參考文獻65-72
• 文獻綜述 Celecoxib靶向腫瘤血管新生通路的研究72-87
• 參考文獻78-87
• 攻讀學位期間發(fā)表的論文87-88
• 致謝88

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本文編號：891657