本文關(guān)鍵詞：腫瘤源性IL-35促進CCL5分泌招募單核細胞

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【摘要】：目的IL-35是一種新發(fā)現(xiàn)的屬于IL-12細胞因子家族的異源二聚體。它含有EB病毒誘導(dǎo)的基因EBI3和IL-27 P35兩個亞基。IL-35具有直接抑制T細胞增殖的免疫抑制的潛力,并且能夠?qū)細胞轉(zhuǎn)變?yōu)榉置贗L-35的r IL35Treg細胞,正是由于IL-35如此強大的免疫抑制功能,并且已研究表明其不只是在T細胞中表達,在B細胞,巨噬細胞,腫瘤細胞中均有表達,那么,在機體任何疾病發(fā)生的原因必然與免疫微環(huán)境的失調(diào)有關(guān),正常的免疫微環(huán)境需要促炎及免疫抑制因子的相平衡,任何一方的失調(diào),即失平衡,必然引起疾病的發(fā)生,對于腫瘤來說,免疫微環(huán)境的改變不但可以成為其發(fā)生因素,在其發(fā)生之后,腫瘤細胞自身將會產(chǎn)生和分泌相關(guān)的細胞因子等來引起免疫微環(huán)境的進一步改變,于此之間的相互作用,必然引起腫瘤的進一步發(fā)生及發(fā)展。現(xiàn)已證實IL-35參與多種疾病的形成過程,包括各種炎癥性疾病、冠狀動脈疾病和癌癥,在炎癥性及免疫性相關(guān)疾病中,例如類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎,哮喘等均有相當(dāng)多的研究報道,但是在腫瘤中對IL-35的研究還很少,我們在前期工作中研究發(fā)現(xiàn)IL-35在胰腺癌組織中及細胞系內(nèi)均有高表達,因為胰腺癌是一個含有豐富間質(zhì)成分的實體瘤,在其中炎性細胞占有很大比重,巨噬細胞是其中的主要細胞亞群,雖然IL-35與T細胞的相關(guān)性已經(jīng)較為透徹,那么作為炎癥細胞重要參與者的巨噬細胞,還沒有過研究報道IL-35與之的相關(guān)性,本研究就在前期預(yù)實驗中發(fā)現(xiàn)了IL-35的表達水平跟腫瘤中局部浸潤的單核/巨噬細胞數(shù)具有相關(guān)性,并且已經(jīng)有大量研究證實了巨噬細胞在腫瘤轉(zhuǎn)移、進展和血管生成等過程中是一個重要的調(diào)節(jié)因子,因此本文為進一步明確IL-35招募單核/巨噬細胞的途徑進行研究,將會對腫瘤的研究進展起到極大的推動作用,并且為臨床的用藥提供新的可能。內(nèi)容和方法一、胰腺導(dǎo)管腺癌中IL-35的表達及與局部浸潤單核巨噬細胞的關(guān)系1.在組織水平的免疫組化染色中,請病理科專業(yè)人員對片子的染色程度進行評分,評級,最后結(jié)果輸入SPSS系統(tǒng)進行統(tǒng)計分析,得出IL-35的表達水平是否與局部浸潤單核巨噬細胞數(shù)就有相關(guān)性,并且統(tǒng)計單核巨噬細胞數(shù)的水平與患者的預(yù)后是否相關(guān)。2.在癌癥基因組數(shù)據(jù)庫(The Cancer Genome Atlas,TCGA)平臺,分析IL-35與單核細胞相關(guān)Marker的相關(guān)性,進一步可以在胰腺癌組織的m RNA水平證實IL-35與單核巨噬細胞的相關(guān)性;二、探究IL-35招募單核/巨噬細胞的途徑1.對過表達IL-35的穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞系進行測序結(jié)果分析,查看IL-35的表達升高能夠引起哪些與招募單核/巨噬細胞相關(guān)的趨化因子在基因水平的改變;2.在TCGA數(shù)據(jù)庫平臺進一步證實IL-35與單核/巨噬細胞相關(guān)的趨化因子是否具有潛在可能的相關(guān)性;3.利用q RT-PCR,Western-blot兩個實驗來驗證,在細胞m RNA及蛋白水平上IL35是否與單核巨噬細胞相關(guān)趨化因子間存在潛在的關(guān)聯(lián)性;4.如果IL-35與單核巨噬細胞相關(guān)的趨化因子間存在相關(guān)性,那么證實在機制水平上,IL-35能夠調(diào)控相關(guān)趨化因子是必須的,因此,我們利用,IL-35重組蛋白的刺激,加入相關(guān)受體的阻斷,觀察趨化因子是否會跟隨發(fā)生相關(guān)的改變,即Western-blot來驗證IL-35促單核巨噬細胞相關(guān)趨化因子分泌的分子機制;5.為了確切得證實其相關(guān)性,那么需要證實在IL-35重組蛋白的刺激下,信號通路是否可以如何與趨化因子的啟動序列區(qū)域的開放閱讀框架相結(jié)合,因此用CHIP來驗證IL-35是否能夠和單核巨噬細胞相關(guān)趨化因子的啟動子區(qū)相結(jié)合,是其之間的調(diào)控更加明確。三、體外功能實驗來驗證IL-35是通過相關(guān)趨化因子來對單核巨噬細胞產(chǎn)生的招募作用1.在機制上走得通,但是必須通過體外功能實驗來進一步的確切,采用密度梯度離心法來分離得到外周血單個核細胞,再并用貼壁法對巨噬細胞進行純化,進行得到相對純化的巨噬細胞;2.用Transwel實驗來驗證穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞系上清對單核巨噬細胞的招募作用,由于IL-35的改變引起下游趨化因子的改變,那么會分泌到細胞的培養(yǎng)上清中,用氣來檢測對巨噬細胞的招募能力,并且對結(jié)果中巨噬細胞的數(shù)量進行統(tǒng)計,再進行統(tǒng)計分析,查看有無統(tǒng)計學(xué)意義。四、體內(nèi)動物實驗來驗證IL-35通過相關(guān)趨化因子對單核巨噬細胞的招募作用。1.小黑鼠皮下種植Pan02過表達及降表達IL-35穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞系及選擇性去除相關(guān)趨化因子及單核細胞組;2.密切觀察小鼠腫瘤大小及小鼠狀態(tài)的變化。結(jié)果一、1.免疫組化的結(jié)果顯示,在組織水平上IL-35的表達高低與局部浸潤的單核巨噬細胞數(shù)具有明顯的統(tǒng)計學(xué)意義,并且單核巨噬細胞的浸潤程度與患者的預(yù)后密切相關(guān),胰腺癌組織局部浸潤的單核巨噬細胞數(shù)增多能夠明顯降低患者的總生存期;2.在TCGA數(shù)據(jù)庫中的胰腺癌組織m RNA水平,用熱圖的形式分析IL-35兩個亞基與單核巨噬細胞的相關(guān)指標(biāo)之間的相關(guān)性,能夠明顯發(fā)現(xiàn)IL-35的兩個亞基與CD11b,CD68,CCR2等單核細胞相關(guān)Marker具有很高相關(guān)性。二、構(gòu)建了胰腺癌過表達IL-35穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞系(PANC-1,Bx PC-3和Pan02)和降表達IL-35穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞系(MIA-paca-2,CFPAC-1和Pan02),并送去測序公司進行基因測序。1.過表達IL-35穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞系的測序結(jié)果表明在過表達IL-35后與對照組細胞相比其與趨化因子相關(guān)的基因(CCL20,CCL2,CCL5,CX3CX1)表達均明顯提高;2.TCGA數(shù)據(jù)分析表明IL-35兩個亞基與CCL2,CCL5兩個趨化因子都具有很高的相關(guān)性;3.q RT-PCR,Western-blot在細胞水平從m RNA及蛋白兩個方面證實IL-35與CCL2及CCL5的相關(guān)性,結(jié)果證實IL-35與CCL5的相關(guān)性較明顯;4.Western-blot來驗證IL-35促CCL5分泌的分子機制是JAK-STAT通路,主要是STAT1和STAT4激活,磷酸化為P-STAT1和P-STAT4入核進行調(diào)控;5.CHIP進一步驗證在IL-35的刺激下,P-STAT1和P-STAT4能否入核與CCL5的啟動子序列進行結(jié)合。三、1.采用密度梯度離心法從外周血中獲得單個核細胞,進一步采用貼壁法對單個核細胞進行純化,來獲得相對較純的單核細胞;2.用Transwell證實IL-35通過促進PDAC分泌CCL5來招募單核巨噬細胞,并將結(jié)果進行統(tǒng)計分析,統(tǒng)計結(jié)果有意義。四、動物的體內(nèi)實驗證實,IL-35的過表達能夠明顯促進腫瘤的生長,如果在過表達IL-35的基礎(chǔ)上阻斷CCL5或者去除單核巨噬細胞,則瘤體的體積明顯縮小,流式檢測IL-35能夠明顯提高腫瘤內(nèi)浸潤的經(jīng)典單核巨噬細胞的數(shù)量,如果在過表達IL-35的基礎(chǔ)上阻斷了CCL5和去除單核巨噬細胞,則招募的經(jīng)典單核巨噬細胞數(shù)明顯下調(diào)。結(jié)論眾所周知,巨噬細胞對于腫瘤的生長、侵襲及轉(zhuǎn)移具有重要作用,因此研究如何阻斷巨噬細胞被招募至腫瘤微環(huán)境局部將具有重要的研究價值,我們首先在組織水平IL-35的表達與局部浸潤的巨噬細胞數(shù)密切相關(guān),IL-35過表達的細胞系測序結(jié)果同樣發(fā)現(xiàn),進一步得就發(fā)現(xiàn)了IL-35與與CCL5的調(diào)控關(guān)系將有可能是對抗腫瘤治療的重要進步。IL-35在胰腺癌中表達,并且能夠促進胰腺癌分泌CCL5來招募單核巨噬細胞,這將為胰腺癌中間質(zhì)嚴重的炎癥及纖維化提供可靠的依據(jù),IL-35在胰腺癌中過表達,那么它在胰腺癌的免疫為微環(huán)境中,具有哪些功能作用需要再進一步的研究。
【關(guān)鍵詞】：胰腺癌 IL-35 單核細胞 CCL5
【學(xué)位授予單位】：天津醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R730.5
【目錄】：

• 中文摘要4-8
• Abstract8-14
• 縮略語/符號說明14-15
• 前言15-18
• 研究現(xiàn)狀、成果15-16
• 研究目的、方法16-18
• 一、IL35與單核/巨噬細胞的關(guān)系18-27
• 1.1 對象和方法18-21
• 1.1.1 標(biāo)本及臨床病理資料18
• 1.1.2 主要試劑18-19
• 1.1.3 主要抗體19
• 1.1.4 主要試劑配置19
• 1.1.5 主要儀器及設(shè)備19-20
• 1.1.6 實驗方法20-21
• 1.1.7 統(tǒng)計學(xué)分析21
• 1.2 結(jié)果21-25
• 1.2.1 TCGA熱圖分析IL-35與單核巨噬細胞相對應(yīng)指標(biāo)的關(guān)系21-22
• 1.2.2 TCGA數(shù)據(jù)庫分析IL-35與單核巨噬細胞相應(yīng)指標(biāo)的相關(guān)性22-23
• 1.2.3 免疫組化分析IL-35的表達水平與局部浸潤單核/巨噬細胞的關(guān)系23-25
• 1.3 討論25-26
• 1.3.1 單核巨噬細胞對腫瘤的影響25
• 1.3.2 IL-35與單核巨噬細胞具有相關(guān)性的臨床意義25-26
• 1.4 小結(jié)26-27
• 二、IL-35招募單核/巨噬細胞的途徑27-47
• 2.1 對象和方法27-38
• 2.1.1 主要細胞系27-28
• 2.1.2 主要試劑28
• 2.1.3 主要抗體28
• 2.1.4 主要試劑配制28-31
• 2.1.5 實驗操作方法31-38
• 2.2 結(jié)果38-45
• 2.2.1 IL-35過表達穩(wěn)系測序結(jié)果分析相關(guān)趨化因子38-41
• 2.2.2 TCGA數(shù)據(jù)庫分析IL-35與相關(guān)趨化因子的相關(guān)性41
• 2.2.3 qRT-PCR及Western-blot驗證IL-35與趨化因子的相關(guān)性41-42
• 2.2.4 胰腺癌組織水平上證實IL-35與CCL5的相關(guān)性42-43
• 2.2.5 Western-blot驗證IL-35促趨化因子分泌的分子機制43-45
• 2.2.6 CHIP驗證IL-35是否與趨化因子的啟動子序列結(jié)合45
• 2.3 討論45-46
• 2.3.1 招募單核巨噬細胞到腫瘤局部都有哪些途徑45-46
• 2.3.2 IL-35主要通過促進CCL5的分泌對單核巨噬細胞產(chǎn)生的招募作用46
• 2.4 小結(jié)46-47
• 三、IL-35招募單核巨噬細胞的體外功能驗證47-53
• 3.1 對象和方法47-48
• 3.1.1 主要試劑47
• 3.1.2 主要材料47
• 3.1.3 主要實驗步驟47-48
• 3.2 結(jié)果48-52
• 3.2.1 IL-35對單核/巨噬細胞具有間接的招募作用48-49
• 3.2.2 IL-35主要通過促進CCL5分泌來對單核/巨噬細胞產(chǎn)生招募作用49-52
• 3.3 討論52
• 3.3.1 IL-35通過間接作用對單核巨噬細胞產(chǎn)生招募作用52
• 3.3.2 阻斷CCL5會顯著降低IL-35對單核細胞的招募作用52
• 3.4 小結(jié)52-53
• 四、體內(nèi)動物實驗驗證IL-35對單核/巨噬細胞的招募作用53-56
• 4.1 對象和方法53
• 4.1.1 主要細胞系及動物53
• 4.1.2 主要試劑53
• 4.1.3 主要儀器設(shè)備53
• 4.1.4 實驗步驟53
• 4.2 結(jié)果53-54
• 4.3 討論54-55
• 4.3.1 IL-35在體內(nèi)仍然可以促進對單核巨噬細胞的招募54-55
• 4.3.2 IL-35在體內(nèi)能夠通過間接的途徑促進瘤體的增長55
• 4.4 小結(jié)55-56
• 結(jié)論56-58
• 參考文獻58-62
• 發(fā)表論文和參加科研情況說明62-63
• 綜述63-71
• 綜述參考文獻68-71
• 致謝71-72
• 個人簡歷72

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本文編號：888595