本文關鍵詞：包裹液態(tài)氟碳的納米粒增效兔VX2瘤射頻消融效果的實驗研究

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【摘要】：研究背景射頻消融(radiofrequency ablation, RFA)是熱消融的一種,它通過射頻發(fā)生器發(fā)出一定頻率的交變電流,激發(fā)電極針周圍組織中離子劇烈震動、摩擦產熱,使腫瘤組織發(fā)生完全凝固性壞死的同時徹底破壞腫瘤微循環(huán)血供從而達到殺傷腫瘤的作用。RFA治療具有操作簡單、可重復實施、療效確切、創(chuàng)傷性小等優(yōu)點,目前已成功運用于肝、腎、肺、子宮附件、甲狀腺、乳腺等臟器腫瘤的微創(chuàng)治療。然而RFA治療腫瘤效果不一,局部復發(fā)率可達到4%-78%不等。治療后殘余腫瘤組織是導致腫瘤復發(fā)的主要原因,因此盡可能大地擴大消融范圍以徹底滅活腫瘤細胞、完全阻斷其微循環(huán)血供是減少腫瘤復發(fā)的有效方法。目前用于擴大射頻消融范圍的方法主要有增加組織局部熱能沉積、提高組織的熱傳導性、降低組織對熱能的耐受以及減少組織局部熱能損失等。近年來,一種新型包裹液態(tài)氟碳的納米級超聲造影劑在疾病診斷以及腫瘤靶向治療方面受到越來越多學者的關注。納米級粒徑范圍的超聲造影劑進入機體后更容易逃脫機體網(wǎng)狀內皮系統(tǒng)的清除作用,在體內循環(huán)時間更長,更容易穿透腫瘤血管屏障并通過滲透和滯留增強效應在腫瘤組織間隙內蓄積。同時,包裹液態(tài)氟碳的超聲造影劑具有液-氣相變潛能,在外界條件作用下(如超聲波、溫度、激光、細針注射等)可發(fā)生相變,伴隨著納米粒體積增大、二維回聲增強等表現(xiàn)。近年來有研究發(fā)現(xiàn)包裹液態(tài)氟碳的超聲造影劑聯(lián)合高強度聚焦超聲(HIFU)消融可有效增強能量沉積,減少局部熱能損失,進而擴大消融范圍。多數(shù)學者認為液態(tài)氟碳的熱致相變作用是增效HIFU消融效果的直接原因。RFA與HIFU的消融機制同屬熱消融治療,理論上包裹液態(tài)氟碳的超聲造影劑在RFA作用下同樣可產生熱相變作用,而關于包裹液態(tài)氟碳的超聲造影劑對射頻消融治療效果的影響還鮮見報道。研究目的本項目首先擬制備一種包裹液態(tài)全氟己烷(Perfluorohexane,PFH)的納米級超聲造影劑,檢測PFH納米粒的理化性質,然后通過體外實驗驗證PFH納米粒的相變潛能；最后通過動物實驗探討PFH納米粒對RFA效果的影響,從超聲造影、病理、腫瘤生長率等方面觀察納米粒的射頻消融增效作用。材料與方法一、儀器與試劑實驗儀器：電子天平(CP2225D型,北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司)；恒溫水浴鍋(DK—S22型,上海精宏實驗設備系統(tǒng)有限公司)；高速分散剪切機(T25基本型,德國IKAULTRA-TURRAX); ATS高速分散均質機(AH-2010);Malvern激光粒度分析儀器(Nano-ISMPT-2);庫爾特濃度分析儀(MultisizerⅢ);掃描電子顯微鏡(S-3000N,HITACHI); C02恒溫培養(yǎng)箱(Thermo Fisher, USA)、超凈工作臺(廣州芯康醫(yī)療科技有限公司),離心機(Thermal Fisher, USA),酶標儀(SpectraMax M5,USA);射頻治療儀(RITA, USA),設定功率35W、溫度100℃、單針消融時間2.0mmin,電極針17Gx10cm; Olympus Celon AG型射頻治療儀(Celon公司),腳踏啟動,消融功率5 W,配有18 G×10 cm單針雙極式射頻針,針尖溫度60-80度；iU22彩色多普勒超聲診斷儀,L12-5高頻線陣探頭,頻率9.0～12.0MHz,配有超聲造影模式(Philips公司)。主要試劑：二棕櫚酰磷脂酰膽堿(DPPC, Avant Polar Lipid)、二棕櫚酰磷脂酸(DPPA, Avant Polar Lipid)、二棕櫚酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇5000(DPPE-PEG5000, Avant Polar Lipid)、全氟己烷液體(PFH, Apolo公司)；1,2-丙二醇、甘油、NaCl粉末、瓊脂粉末(北京百靈威化學試劑有限公司)、蒸餾水；MTT(碧云天生物科技有限公司)、DMSO(Sigma公司)、PRM-1640(Hyclone公司)、胎牛血清(FBS,Hyclone公司)、磷酸鹽緩沖液(PBS,碧云天生物科技有限公司)、0.25%胰蛋白酶(碧云天生物科技有限公司)；聲諾維SonoVue(Bracco公司)；速眠新Ⅱ注射液,阿托品,3%戊巴比妥鈉,肝素。二、PFH納米粒的制備及理化性質檢測1.納米粒的制備采用均質-乳勻法制備納米粒。按摩爾比稱取一定量的DPPC、DPPE-PEG5000以及DPPA,加至丙二醇溶液中使完全溶解,再加入一定量的甘油和NaCl水溶液,于70℃水浴順時針震蕩至完全溶解,制成磷脂分散液。將上述磷脂分散液加入50 mL聚丙烯管內,冷卻后加入PFH,冰浴條件下剪切(頻率24000 r min一1、時間3 min),制得包裹PFH的初乳,再將初乳置于高速分散均質機乳勻,設置均質壓力及次數(shù),制得包裹PFH的納米粒。2.納米粒理化性質檢測取制備好的納米粒經(jīng)超純水適當稀釋后,馬爾文激光粒度分析儀檢測納米粒粒徑范圍、電位及多分散系數(shù)；掃描電子顯微鏡觀察納米粒表面形態(tài)；庫爾特分析儀檢測濃度。三、包裹PFH納米粒生物相容性檢測1.細胞增殖活性檢測采用甲基噻唑基四唑(MT,T)法檢測PFH納米粒對結腸癌細胞SW480增殖活性的影響。取對數(shù)生長期的SW-480細胞,經(jīng)胰蛋白酶消化后,用含10%FBS的PRMI-1640細胞培養(yǎng)液稀釋制成細胞濃度約為5×104個/ml的細胞懸液備用。取100ul細胞懸液至96孔培養(yǎng)板,37-C培養(yǎng)24h后細胞貼壁生長。取出96孔板,按濃度(0--1.2×109個/ml,用無血清的培養(yǎng)基稀釋)加入PFH納米粒后放入C02培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24h。繼而向各孔分別加入10ul MTT溶液(5mg/mL),37-C繼續(xù)培養(yǎng)4 h,棄除上清液。每孔分別加入150ul二甲基亞砜(DMSO),搖床震蕩10 mmin。酶標儀490 nm波長處測各孔光密度(OD)值。2.體外溶血試驗自新西蘭白兔耳緣靜脈采血10ml置于離心管內,肝素化(棉簽不斷攪拌)以除去纖維蛋白,1500r/min離心1 5min,棄上清,再加入生理鹽水洗滌,均離心后棄上清,多次離心直至上清液無紅色,取沉淀,用生理鹽水配成2%的紅細胞混懸液,備用。離心管7支,編號,每管內溶液總量為5m1,每管內依次加入2%紅細胞混懸液2.5 ml。1-5號管為實驗組,每管內依次加入不同量(0.2,0.4,0.6,0.8,1.0 mL)的PFH納米粒溶液及5%的葡萄糖溶液定容。6號管為陰性對照,加入2.5ml5%葡萄糖溶液,7號管為陽性對照,加入2.5ml蒸餾水�；靹蚝�,置于37℃恒溫水浴鍋中,觀察并記錄各管的溶血情況。四、PFH納米粒體外相變1.水囊加熱取上述制備好的PFH納米粒溶液2ml、脫氣水120 ml混勻稀釋后備用。取100 ml稀釋納米粒溶液、100ml脫氣水分別裝于兩個特制小囊中并密封,將兩個小囊置于不同溫度水浴箱中同時行二維超聲顯像,采集動態(tài)圖像并存儲。2.瓊脂模型射頻消融稱取6 g瓊脂粉溶于400 ml沸水并分裝于兩個容器中,待溫度降至40℃時,取2ml稀釋納米粒溶液及2ml脫氣水分別加入瓊脂混懸液中,玻璃棒輕微攪拌至完全混勻,常溫下靜置60min待其完全凝固后備用。超聲引導下分別對瓊脂塊行射頻消融,用瑞達射頻儀,設定功率35 w,時間2.0 min,設定溫度100℃,其實際溫度可以達到87℃,二維超聲實時動態(tài)觀察消融區(qū)回聲改變。五、PFH納米粒影響兔VX2瘤射頻消融效果1.實驗動物模型建立健康新西蘭大白兔40只,雌雄不拘,體質量2.5～3.0kg,由南方醫(yī)科大學附屬南方醫(yī)院實驗動物中心提供。VX2瘤組織懸液由廣州中山大學實驗動物中心提供。取VX2瘤組織懸液1ml接種至傳代兔右后肢外側肌層內組織內。接種后常規(guī)觀察腫瘤生長情況,2周左右瘤組織進行傳代。使用速眠新Ⅱ(0.3ml/kg)、阿托品注射液(0.2ml/kg)對傳代兔行肌注麻醉滿意后,建立兔耳緣靜脈通道,使用3%戊巴比妥鈉(0.2ml/kg)對傳代兔行靜脈麻醉。傳代兔側臥位固定于實驗臺上,脫毛,充分暴露荷瘤區(qū),消毒,無菌條件下取出腫瘤組織并迅速剔除周邊結締組織及中央壞死區(qū),將剩余的新鮮魚肉樣組織置于無菌生理鹽水中,眼科剪將其剪成lmm3的小塊,分別接種至40只健康新西蘭大白兔右后肢外側肌層內。常規(guī)超聲監(jiān)測腫瘤生長情況,約15天左右,超聲測量腫瘤最大切面直徑為1.0～1.5 cm時,兔肌層VX2腫瘤模型建立成功,備用。2.實驗分組將腫瘤種植成功的36只荷瘤兔隨機分成3組,每組12只。實驗組包括單純RFA治療組(I組),納米粒+RFA治療組(Ⅱ組)；對照組(Ⅲ組)為空白對照組。I組,經(jīng)耳緣靜脈推注0.4 ml/kg的生理鹽水(0.9%)聯(lián)合RFA治療。Ⅱ組,經(jīng)耳緣靜脈推注0.4 ml/kg納米粒聯(lián)合RFA治療。用Olympus Celon AG型射頻治療儀,腳踏啟動,消融條件一致,單針消融。Ⅲ組,不做任何處理,僅為空白對照。3.超聲檢查常規(guī)超聲觀察實驗組治療前后及對照組腫瘤回聲情況,軌跡法勾畫腫瘤最大切面面積(A0)。超聲造影觀察各組腫瘤治療前后造影劑灌注情況,儲存動態(tài)造影圖像,選取造影缺損區(qū)最大切面,軌跡法勾畫造影缺損區(qū)面積(AD)。4.病理觀察治療后每組隨機抽取3只荷瘤兔,空氣栓塞法處死,沿針道切開腫瘤,觀察腫瘤及消融灶的肉眼改變。將各組切取的腫瘤組織固定,脫水,包埋,切片,HE染色,光鏡觀察各組腫瘤組織壞死情況。5前中瘤生長情況觀察常規(guī)超聲動態(tài)觀察27天腫瘤生長情況,每隔3天測量腫瘤面積,繪制腫瘤生長曲線。計算腫瘤生長率,比較各組差異。腫瘤生長率采用公式X27(%)=100%×(A27-A0)/A0計算(X27：治療后27天腫瘤相對生長率；A27：第27天腫瘤面積；AO：處理前腫瘤面積)。六、統(tǒng)計學分析采用SPSS 20.0統(tǒng)計學分析軟件,計量資料采用均數(shù)±標準差表示。各組間統(tǒng)計結果的比較用one-way ANOVA,各組間兩兩比較采用LSD法,以P0.05為差異有統(tǒng)計學意義。結果一、PFH納米粒的一般特性制備好的納米粒為白色乳狀液,短時間靜置后未見明顯分層現(xiàn)象；掃描電子顯微鏡下可見納米粒呈圓球形,表面尚光滑,分布基本均勻,彼此無明顯聚集現(xiàn)象；Malvern激光粒度分析儀器測得納米粒平均粒徑為(288.7±36)nm,電位為(-2.44+0.18)mV,多分散系數(shù)為0.0622±0.014；庫爾特濃度分析儀測得納米粒濃度為1.2×109個/ml。二、PFH納米粒生物相容性檢測1.細胞增殖活性影響在實驗中給定的PFH納米粒濃度范圍(0-1.2×105個/ml)內,結腸癌SW480細胞的增殖活性未見明顯改變,各組OD值差異無統(tǒng)計學意義。2.體外溶血試驗陽性對照組表現(xiàn)為管內液體為橙紅色,管底未見明顯紅細胞。葡萄糖稀釋的不同濃度納米粒組以及陰性對照組在15、45、90、180mmin均未發(fā)生溶血及紅細胞凝集現(xiàn)象,表現(xiàn)為管內紅細胞完全下沉,上層液體為無色透明。三、PFH納米粒體外相變實驗1.水囊加熱超聲顯影效果加熱前,二維超聲可見PFH納米粒組、脫氣水組回聲均極低,接近無回聲,回聲強度分別為(0.18±0.04)dB.(0.23±0.09)dB;加熱至78℃時,PFH納米粒組水囊內有較多氣體樣強回聲產生,由底部向上運動,回聲較加熱前明顯增強,而脫氣水組水囊內未見明顯氣體產生,回聲較加熱前無明顯改變,回聲強度分別為(26.49±0.71)dB.(0.25±0.05)dB;加熱前、后二維回聲強度比較,PFH納米粒組差異具有統(tǒng)計學意義(P0.05),脫氣水組差異無統(tǒng)計學意義(P=0.46)。2.瓊脂模型射頻消融啟動射頻消融前,PFH納米粒組及單純瓊脂組均表現(xiàn)為無回聲；啟動消融后當射頻針溫度達到額定溫度時,PFH納米粒組射頻針周圍可見明顯高回聲區(qū)形成,而單純瓊脂組射頻針周圍僅見少許點狀高回聲散在分布。四、PFH納米粒影響兔VX2腫瘤射頻消融效果1.VX2移植瘤模型建立1只瘤兔在實驗中因麻醉過量死亡,3個移植瘤治療前超聲造影顯示有大范圍壞死,均被排除實驗。用于實驗的36個移植瘤平均面積66.56±3.16mm2,,組間未見統(tǒng)計學差異(P=0.10)。2.超聲表現(xiàn)常規(guī)超聲示治療前,移植瘤均表現(xiàn)為低回聲結節(jié)、呈類圓形、邊界較清；治療后實驗組均形成消融灶,表現(xiàn)為不均勻低回聲區(qū)、內有點狀強回聲散在分布,對照組無消融灶形成,回聲無明顯改變。超聲造影示治療前,各組移植瘤內均有造影劑灌注,部分移植瘤中央有小范圍造影缺損區(qū),面積為(5.32±1.73)mm2,組間無統(tǒng)計學差異(P0.05)；治療后實驗組(Ⅰ、Ⅱ組)腫瘤組織內均出現(xiàn)大范圍造影缺損區(qū),對照組(Ⅲ組)腫瘤組織內未見明顯造影缺損區(qū)。治療后各組造影缺損區(qū)面積分別為：Ⅰ組(41.46±2.70)mm2、II組(62.33±1.59)mmm2、Ⅲ組(5.22±1.61)mmm2,各組間比較差異有統(tǒng)計學意義(P0.05)。3.病理表現(xiàn)肉眼及光鏡下均證實實驗組靶區(qū)腫瘤組織發(fā)生不可逆壞死,而對照組無明顯壞死。①肉眼下,實驗組(Ⅰ、Ⅱ組)消融區(qū)均有橢球形壞死灶形成,為灰白色、質硬、缺乏彈性,中央可見窄條狀針道,與鄰近組織分界清楚；對照組腫瘤區(qū)未見明顯壞死灶,腫瘤呈灰白色魚肉狀,質地較緊密,富有彈性(圖3-1)。(②光鏡下,實驗組(Ⅰ、Ⅱ組)消融區(qū)與腫瘤組織有明顯分界,消融區(qū)顯示腫瘤細胞核固縮,胞漿疏松,散在微小血管顯著擴張,腫瘤間質內可見溢出的紅細胞,形成不規(guī)則血栓,呈局灶性分布；對照組腫瘤細胞排列緊密,大小不一,形狀各異,無明顯細胞固縮現(xiàn)象。4.腫瘤生長情況治療后27天,各組腫瘤生長率分別達到Ⅰ組：160.61±16.06%、Ⅱ組：57.04±9.88%、Ⅲ組：308.08±22.90%,三組比較差異有統(tǒng)計學意義,PFH納米粒聯(lián)合RFA治療組腫瘤生長率顯著低于單純RFA治療組以及空白對照組(P0.05)。結論1.本實驗以DPPC.DPPE-PEG5000.DPPA為成膜材料、以液態(tài)PFH為被包裹材料,采用均質-乳勻法制得了濃度較高、粒徑均勻且為納米級的脂質微球混懸液。2.本實驗制得的PFH納米粒具有良好的生物相容性,無明顯生物毒性,為以后應用于臨床奠定了基礎。3.本實驗制得的納米粒由于其內包裹特殊的生物材料—液態(tài)全氟己烷,因而具有熱相變潛能,即由液態(tài)轉變?yōu)闅鈶B(tài),同時在常規(guī)二維超聲上表現(xiàn)為高回聲。4.本實驗通過兔VX2瘤射頻消融實驗證實,消融過程中加入制備的PFH納米�？擅黠@擴大消融范圍,增加消融效果。
【關鍵詞】：射頻消融 全氟己烷 納米粒 熱相變 增效
【學位授予單位】：南方醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R730.5;R445.1
【目錄】：

• 摘要3-12
• ABSTRACT12-21
• 前言21-33
• 參考文獻28-33
• 第一章 包裹液態(tài)氟碳納米粒的制備及生物相容性實驗33-42
• 1.1 材料與方法34-36
• 1.2 結果36-37
• 1.3 討論37-40
• 參考文獻40-42
• 第二章 包裹液態(tài)氟碳納米粒體外相變實驗42-48
• 2.1 材料與方法43-44
• 2.2 結果44-46
• 2.3 討論46-47
• 參考文獻47-48
• 第三章 包裹液態(tài)氟碳納米粒對兔VX2瘤射頻消融效果影響48-61
• 3.1 材料與方法49-51
• 3.2 結果51-54
• 3.3 討論54-58
• 參考文獻58-61
• 碩士研究生期間發(fā)表的文章61-62
• 致謝62-63

【參考文獻】

中國碩士學位論文全文數(shù)據(jù)庫 前1條

1 沈紅霞;包裹液態(tài)氟碳的PLGA微球增強HIFU能量沉積的實驗研究[D];重慶醫(yī)科大學;2012年

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本文編號：887890