本文關(guān)鍵詞：包裹液態(tài)氟碳的納米粒增效兔VX2瘤射頻消融效果的實(shí)驗(yàn)研究

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【摘要】：研究背景射頻消融(radiofrequency ablation, RFA)是熱消融的一種,它通過射頻發(fā)生器發(fā)出一定頻率的交變電流,激發(fā)電極針周圍組織中離子劇烈震動(dòng)、摩擦產(chǎn)熱,使腫瘤組織發(fā)生完全凝固性壞死的同時(shí)徹底破壞腫瘤微循環(huán)血供從而達(dá)到殺傷腫瘤的作用。RFA治療具有操作簡單、可重復(fù)實(shí)施、療效確切、創(chuàng)傷性小等優(yōu)點(diǎn),目前已成功運(yùn)用于肝、腎、肺、子宮附件、甲狀腺、乳腺等臟器腫瘤的微創(chuàng)治療。然而RFA治療腫瘤效果不一,局部復(fù)發(fā)率可達(dá)到4%-78%不等。治療后殘余腫瘤組織是導(dǎo)致腫瘤復(fù)發(fā)的主要原因,因此盡可能大地?cái)U(kuò)大消融范圍以徹底滅活腫瘤細(xì)胞、完全阻斷其微循環(huán)血供是減少腫瘤復(fù)發(fā)的有效方法。目前用于擴(kuò)大射頻消融范圍的方法主要有增加組織局部熱能沉積、提高組織的熱傳導(dǎo)性、降低組織對熱能的耐受以及減少組織局部熱能損失等。近年來,一種新型包裹液態(tài)氟碳的納米級(jí)超聲造影劑在疾病診斷以及腫瘤靶向治療方面受到越來越多學(xué)者的關(guān)注。納米級(jí)粒徑范圍的超聲造影劑進(jìn)入機(jī)體后更容易逃脫機(jī)體網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)的清除作用,在體內(nèi)循環(huán)時(shí)間更長,更容易穿透腫瘤血管屏障并通過滲透和滯留增強(qiáng)效應(yīng)在腫瘤組織間隙內(nèi)蓄積。同時(shí),包裹液態(tài)氟碳的超聲造影劑具有液-氣相變潛能,在外界條件作用下(如超聲波、溫度、激光、細(xì)針注射等)可發(fā)生相變,伴隨著納米粒體積增大、二維回聲增強(qiáng)等表現(xiàn)。近年來有研究發(fā)現(xiàn)包裹液態(tài)氟碳的超聲造影劑聯(lián)合高強(qiáng)度聚焦超聲(HIFU)消融可有效增強(qiáng)能量沉積,減少局部熱能損失,進(jìn)而擴(kuò)大消融范圍。多數(shù)學(xué)者認(rèn)為液態(tài)氟碳的熱致相變作用是增效HIFU消融效果的直接原因。RFA與HIFU的消融機(jī)制同屬熱消融治療,理論上包裹液態(tài)氟碳的超聲造影劑在RFA作用下同樣可產(chǎn)生熱相變作用,而關(guān)于包裹液態(tài)氟碳的超聲造影劑對射頻消融治療效果的影響還鮮見報(bào)道。研究目的本項(xiàng)目首先擬制備一種包裹液態(tài)全氟己烷(Perfluorohexane,PFH)的納米級(jí)超聲造影劑,檢測PFH納米粒的理化性質(zhì),然后通過體外實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證PFH納米粒的相變潛能；最后通過動(dòng)物實(shí)驗(yàn)探討PFH納米粒對RFA效果的影響,從超聲造影、病理、腫瘤生長率等方面觀察納米粒的射頻消融增效作用。材料與方法一、儀器與試劑實(shí)驗(yàn)儀器：電子天平(CP2225D型,北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司)；恒溫水浴鍋(DK—S22型,上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備系統(tǒng)有限公司)；高速分散剪切機(jī)(T25基本型,德國IKAULTRA-TURRAX); ATS高速分散均質(zhì)機(jī)(AH-2010);Malvern激光粒度分析儀器(Nano-ISMPT-2);庫爾特濃度分析儀(MultisizerⅢ);掃描電子顯微鏡(S-3000N,HITACHI); C02恒溫培養(yǎng)箱(Thermo Fisher, USA)、超凈工作臺(tái)(廣州芯康醫(yī)療科技有限公司),離心機(jī)(Thermal Fisher, USA),酶標(biāo)儀(SpectraMax M5,USA);射頻治療儀(RITA, USA),設(shè)定功率35W、溫度100℃、單針消融時(shí)間2.0mmin,電極針17Gx10cm; Olympus Celon AG型射頻治療儀(Celon公司),腳踏啟動(dòng),消融功率5 W,配有18 G×10 cm單針雙極式射頻針,針尖溫度60-80度；iU22彩色多普勒超聲診斷儀,L12-5高頻線陣探頭,頻率9.0～12.0MHz,配有超聲造影模式(Philips公司)。主要試劑：二棕櫚酰磷脂酰膽堿(DPPC, Avant Polar Lipid)、二棕櫚酰磷脂酸(DPPA, Avant Polar Lipid)、二棕櫚酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇5000(DPPE-PEG5000, Avant Polar Lipid)、全氟己烷液體(PFH, Apolo公司)；1,2-丙二醇、甘油、NaCl粉末、瓊脂粉末(北京百靈威化學(xué)試劑有限公司)、蒸餾水；MTT(碧云天生物科技有限公司)、DMSO(Sigma公司)、PRM-1640(Hyclone公司)、胎牛血清(FBS,Hyclone公司)、磷酸鹽緩沖液(PBS,碧云天生物科技有限公司)、0.25%胰蛋白酶(碧云天生物科技有限公司)；聲諾維SonoVue(Bracco公司)；速眠新Ⅱ注射液,阿托品,3%戊巴比妥鈉,肝素。二、PFH納米粒的制備及理化性質(zhì)檢測1.納米粒的制備采用均質(zhì)-乳勻法制備納米粒。按摩爾比稱取一定量的DPPC、DPPE-PEG5000以及DPPA,加至丙二醇溶液中使完全溶解,再加入一定量的甘油和NaCl水溶液,于70℃水浴順時(shí)針震蕩至完全溶解,制成磷脂分散液。將上述磷脂分散液加入50 mL聚丙烯管內(nèi),冷卻后加入PFH,冰浴條件下剪切(頻率24000 r min一1、時(shí)間3 min),制得包裹PFH的初乳,再將初乳置于高速分散均質(zhì)機(jī)乳勻,設(shè)置均質(zhì)壓力及次數(shù),制得包裹PFH的納米粒。2.納米粒理化性質(zhì)檢測取制備好的納米粒經(jīng)超純水適當(dāng)稀釋后,馬爾文激光粒度分析儀檢測納米粒粒徑范圍、電位及多分散系數(shù)；掃描電子顯微鏡觀察納米粒表面形態(tài)；庫爾特分析儀檢測濃度。三、包裹PFH納米粒生物相容性檢測1.細(xì)胞增殖活性檢測采用甲基噻唑基四唑(MT,T)法檢測PFH納米粒對結(jié)腸癌細(xì)胞SW480增殖活性的影響。取對數(shù)生長期的SW-480細(xì)胞,經(jīng)胰蛋白酶消化后,用含10%FBS的PRMI-1640細(xì)胞培養(yǎng)液稀釋制成細(xì)胞濃度約為5×104個(gè)/ml的細(xì)胞懸液備用。取100ul細(xì)胞懸液至96孔培養(yǎng)板,37-C培養(yǎng)24h后細(xì)胞貼壁生長。取出96孔板,按濃度(0--1.2×109個(gè)/ml,用無血清的培養(yǎng)基稀釋)加入PFH納米粒后放入C02培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24h。繼而向各孔分別加入10ul MTT溶液(5mg/mL),37-C繼續(xù)培養(yǎng)4 h,棄除上清液。每孔分別加入150ul二甲基亞砜(DMSO),搖床震蕩10 mmin。酶標(biāo)儀490 nm波長處測各孔光密度(OD)值。2.體外溶血試驗(yàn)自新西蘭白兔耳緣靜脈采血10ml置于離心管內(nèi),肝素化(棉簽不斷攪拌)以除去纖維蛋白,1500r/min離心1 5min,棄上清,再加入生理鹽水洗滌,均離心后棄上清,多次離心直至上清液無紅色,取沉淀,用生理鹽水配成2%的紅細(xì)胞混懸液,備用。離心管7支,編號(hào),每管內(nèi)溶液總量為5m1,每管內(nèi)依次加入2%紅細(xì)胞混懸液2.5 ml。1-5號(hào)管為實(shí)驗(yàn)組,每管內(nèi)依次加入不同量(0.2,0.4,0.6,0.8,1.0 mL)的PFH納米粒溶液及5%的葡萄糖溶液定容。6號(hào)管為陰性對照,加入2.5ml5%葡萄糖溶液,7號(hào)管為陽性對照,加入2.5ml蒸餾水。混勻后,置于37℃恒溫水浴鍋中,觀察并記錄各管的溶血情況。四、PFH納米粒體外相變1.水囊加熱取上述制備好的PFH納米粒溶液2ml、脫氣水120 ml混勻稀釋后備用。取100 ml稀釋納米粒溶液、100ml脫氣水分別裝于兩個(gè)特制小囊中并密封,將兩個(gè)小囊置于不同溫度水浴箱中同時(shí)行二維超聲顯像,采集動(dòng)態(tài)圖像并存儲(chǔ)。2.瓊脂模型射頻消融稱取6 g瓊脂粉溶于400 ml沸水并分裝于兩個(gè)容器中,待溫度降至40℃時(shí),取2ml稀釋納米粒溶液及2ml脫氣水分別加入瓊脂混懸液中,玻璃棒輕微攪拌至完全混勻,常溫下靜置60min待其完全凝固后備用。超聲引導(dǎo)下分別對瓊脂塊行射頻消融,用瑞達(dá)射頻儀,設(shè)定功率35 w,時(shí)間2.0 min,設(shè)定溫度100℃,其實(shí)際溫度可以達(dá)到87℃,二維超聲實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)觀察消融區(qū)回聲改變。五、PFH納米粒影響兔VX2瘤射頻消融效果1.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型建立健康新西蘭大白兔40只,雌雄不拘,體質(zhì)量2.5～3.0kg,由南方醫(yī)科大學(xué)附屬南方醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。VX2瘤組織懸液由廣州中山大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。取VX2瘤組織懸液1ml接種至傳代兔右后肢外側(cè)肌層內(nèi)組織內(nèi)。接種后常規(guī)觀察腫瘤生長情況,2周左右瘤組織進(jìn)行傳代。使用速眠新Ⅱ(0.3ml/kg)、阿托品注射液(0.2ml/kg)對傳代兔行肌注麻醉滿意后,建立兔耳緣靜脈通道,使用3%戊巴比妥鈉(0.2ml/kg)對傳代兔行靜脈麻醉。傳代兔側(cè)臥位固定于實(shí)驗(yàn)臺(tái)上,脫毛,充分暴露荷瘤區(qū),消毒,無菌條件下取出腫瘤組織并迅速剔除周邊結(jié)締組織及中央壞死區(qū),將剩余的新鮮魚肉樣組織置于無菌生理鹽水中,眼科剪將其剪成lmm3的小塊,分別接種至40只健康新西蘭大白兔右后肢外側(cè)肌層內(nèi)。常規(guī)超聲監(jiān)測腫瘤生長情況,約15天左右,超聲測量腫瘤最大切面直徑為1.0～1.5 cm時(shí),兔肌層VX2腫瘤模型建立成功,備用。2.實(shí)驗(yàn)分組將腫瘤種植成功的36只荷瘤兔隨機(jī)分成3組,每組12只。實(shí)驗(yàn)組包括單純RFA治療組(I組),納米粒+RFA治療組(Ⅱ組)；對照組(Ⅲ組)為空白對照組。I組,經(jīng)耳緣靜脈推注0.4 ml/kg的生理鹽水(0.9%)聯(lián)合RFA治療。Ⅱ組,經(jīng)耳緣靜脈推注0.4 ml/kg納米粒聯(lián)合RFA治療。用Olympus Celon AG型射頻治療儀,腳踏啟動(dòng),消融條件一致,單針消融。Ⅲ組,不做任何處理,僅為空白對照。3.超聲檢查常規(guī)超聲觀察實(shí)驗(yàn)組治療前后及對照組腫瘤回聲情況,軌跡法勾畫腫瘤最大切面面積(A0)。超聲造影觀察各組腫瘤治療前后造影劑灌注情況,儲(chǔ)存動(dòng)態(tài)造影圖像,選取造影缺損區(qū)最大切面,軌跡法勾畫造影缺損區(qū)面積(AD)。4.病理觀察治療后每組隨機(jī)抽取3只荷瘤兔,空氣栓塞法處死,沿針道切開腫瘤,觀察腫瘤及消融灶的肉眼改變。將各組切取的腫瘤組織固定,脫水,包埋,切片,HE染色,光鏡觀察各組腫瘤組織壞死情況。5前中瘤生長情況觀察常規(guī)超聲動(dòng)態(tài)觀察27天腫瘤生長情況,每隔3天測量腫瘤面積,繪制腫瘤生長曲線。計(jì)算腫瘤生長率,比較各組差異。腫瘤生長率采用公式X27(%)=100%×(A27-A0)/A0計(jì)算(X27：治療后27天腫瘤相對生長率；A27：第27天腫瘤面積；AO：處理前腫瘤面積)。六、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)學(xué)分析軟件,計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。各組間統(tǒng)計(jì)結(jié)果的比較用one-way ANOVA,各組間兩兩比較采用LSD法,以P0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果一、PFH納米粒的一般特性制備好的納米粒為白色乳狀液,短時(shí)間靜置后未見明顯分層現(xiàn)象；掃描電子顯微鏡下可見納米粒呈圓球形,表面尚光滑,分布基本均勻,彼此無明顯聚集現(xiàn)象；Malvern激光粒度分析儀器測得納米粒平均粒徑為(288.7±36)nm,電位為(-2.44+0.18)mV,多分散系數(shù)為0.0622±0.014；庫爾特濃度分析儀測得納米粒濃度為1.2×109個(gè)/ml。二、PFH納米粒生物相容性檢測1.細(xì)胞增殖活性影響在實(shí)驗(yàn)中給定的PFH納米粒濃度范圍(0-1.2×105個(gè)/ml)內(nèi),結(jié)腸癌SW480細(xì)胞的增殖活性未見明顯改變,各組OD值差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。2.體外溶血試驗(yàn)陽性對照組表現(xiàn)為管內(nèi)液體為橙紅色,管底未見明顯紅細(xì)胞。葡萄糖稀釋的不同濃度納米粒組以及陰性對照組在15、45、90、180mmin均未發(fā)生溶血及紅細(xì)胞凝集現(xiàn)象,表現(xiàn)為管內(nèi)紅細(xì)胞完全下沉,上層液體為無色透明。三、PFH納米粒體外相變實(shí)驗(yàn)1.水囊加熱超聲顯影效果加熱前,二維超聲可見PFH納米粒組、脫氣水組回聲均極低,接近無回聲,回聲強(qiáng)度分別為(0.18±0.04)dB.(0.23±0.09)dB;加熱至78℃時(shí),PFH納米粒組水囊內(nèi)有較多氣體樣強(qiáng)回聲產(chǎn)生,由底部向上運(yùn)動(dòng),回聲較加熱前明顯增強(qiáng),而脫氣水組水囊內(nèi)未見明顯氣體產(chǎn)生,回聲較加熱前無明顯改變,回聲強(qiáng)度分別為(26.49±0.71)dB.(0.25±0.05)dB;加熱前、后二維回聲強(qiáng)度比較,PFH納米粒組差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),脫氣水組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.46)。2.瓊脂模型射頻消融啟動(dòng)射頻消融前,PFH納米粒組及單純瓊脂組均表現(xiàn)為無回聲；啟動(dòng)消融后當(dāng)射頻針溫度達(dá)到額定溫度時(shí),PFH納米粒組射頻針周圍可見明顯高回聲區(qū)形成,而單純瓊脂組射頻針周圍僅見少許點(diǎn)狀高回聲散在分布。四、PFH納米粒影響兔VX2腫瘤射頻消融效果1.VX2移植瘤模型建立1只瘤兔在實(shí)驗(yàn)中因麻醉過量死亡,3個(gè)移植瘤治療前超聲造影顯示有大范圍壞死,均被排除實(shí)驗(yàn)。用于實(shí)驗(yàn)的36個(gè)移植瘤平均面積66.56±3.16mm2,,組間未見統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P=0.10)。2.超聲表現(xiàn)常規(guī)超聲示治療前,移植瘤均表現(xiàn)為低回聲結(jié)節(jié)、呈類圓形、邊界較清；治療后實(shí)驗(yàn)組均形成消融灶,表現(xiàn)為不均勻低回聲區(qū)、內(nèi)有點(diǎn)狀強(qiáng)回聲散在分布,對照組無消融灶形成,回聲無明顯改變。超聲造影示治療前,各組移植瘤內(nèi)均有造影劑灌注,部分移植瘤中央有小范圍造影缺損區(qū),面積為(5.32±1.73)mm2,組間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05)；治療后實(shí)驗(yàn)組(Ⅰ、Ⅱ組)腫瘤組織內(nèi)均出現(xiàn)大范圍造影缺損區(qū),對照組(Ⅲ組)腫瘤組織內(nèi)未見明顯造影缺損區(qū)。治療后各組造影缺損區(qū)面積分別為：Ⅰ組(41.46±2.70)mm2、II組(62.33±1.59)mmm2、Ⅲ組(5.22±1.61)mmm2,各組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。3.病理表現(xiàn)肉眼及光鏡下均證實(shí)實(shí)驗(yàn)組靶區(qū)腫瘤組織發(fā)生不可逆壞死,而對照組無明顯壞死。①肉眼下,實(shí)驗(yàn)組(Ⅰ、Ⅱ組)消融區(qū)均有橢球形壞死灶形成,為灰白色、質(zhì)硬、缺乏彈性,中央可見窄條狀針道,與鄰近組織分界清楚；對照組腫瘤區(qū)未見明顯壞死灶,腫瘤呈灰白色魚肉狀,質(zhì)地較緊密,富有彈性(圖3-1)。(②光鏡下,實(shí)驗(yàn)組(Ⅰ、Ⅱ組)消融區(qū)與腫瘤組織有明顯分界,消融區(qū)顯示腫瘤細(xì)胞核固縮,胞漿疏松,散在微小血管顯著擴(kuò)張,腫瘤間質(zhì)內(nèi)可見溢出的紅細(xì)胞,形成不規(guī)則血栓,呈局灶性分布；對照組腫瘤細(xì)胞排列緊密,大小不一,形狀各異,無明顯細(xì)胞固縮現(xiàn)象。4.腫瘤生長情況治療后27天,各組腫瘤生長率分別達(dá)到Ⅰ組：160.61±16.06%、Ⅱ組：57.04±9.88%、Ⅲ組：308.08±22.90%,三組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,PFH納米粒聯(lián)合RFA治療組腫瘤生長率顯著低于單純RFA治療組以及空白對照組(P0.05)。結(jié)論1.本實(shí)驗(yàn)以DPPC.DPPE-PEG5000.DPPA為成膜材料、以液態(tài)PFH為被包裹材料,采用均質(zhì)-乳勻法制得了濃度較高、粒徑均勻且為納米級(jí)的脂質(zhì)微球混懸液。2.本實(shí)驗(yàn)制得的PFH納米粒具有良好的生物相容性,無明顯生物毒性,為以后應(yīng)用于臨床奠定了基礎(chǔ)。3.本實(shí)驗(yàn)制得的納米粒由于其內(nèi)包裹特殊的生物材料—液態(tài)全氟己烷,因而具有熱相變潛能,即由液態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)闅鈶B(tài),同時(shí)在常規(guī)二維超聲上表現(xiàn)為高回聲。4.本實(shí)驗(yàn)通過兔VX2瘤射頻消融實(shí)驗(yàn)證實(shí),消融過程中加入制備的PFH納米粒可明顯擴(kuò)大消融范圍,增加消融效果。
【關(guān)鍵詞】：射頻消融 全氟己烷 納米粒 熱相變 增效
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R730.5;R445.1
【目錄】：

• 摘要3-12
• ABSTRACT12-21
• 前言21-33
• 參考文獻(xiàn)28-33
• 第一章 包裹液態(tài)氟碳納米粒的制備及生物相容性實(shí)驗(yàn)33-42
• 1.1 材料與方法34-36
• 1.2 結(jié)果36-37
• 1.3 討論37-40
• 參考文獻(xiàn)40-42
• 第二章 包裹液態(tài)氟碳納米粒體外相變實(shí)驗(yàn)42-48
• 2.1 材料與方法43-44
• 2.2 結(jié)果44-46
• 2.3 討論46-47
• 參考文獻(xiàn)47-48
• 第三章 包裹液態(tài)氟碳納米粒對兔VX2瘤射頻消融效果影響48-61
• 3.1 材料與方法49-51
• 3.2 結(jié)果51-54
• 3.3 討論54-58
• 參考文獻(xiàn)58-61
• 碩士研究生期間發(fā)表的文章61-62
• 致謝62-63

【參考文獻(xiàn)】

中國碩士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫 前1條

1 沈紅霞;包裹液態(tài)氟碳的PLGA微球增強(qiáng)HIFU能量沉積的實(shí)驗(yàn)研究[D];重慶醫(yī)科大學(xué);2012年

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本文編號(hào)：887890