本文關(guān)鍵詞：IL-17通過抑制MDSCs凋亡影響小鼠抗瘤免疫應(yīng)答的實驗研究

  更多相關(guān)文章： 白細(xì)胞介素-17 髓源性抑制性細(xì)胞 凋亡 ERK1/2分子

【摘要】：目的:體外觀察白細(xì)胞介素17(interleukin17,IL-17)對小鼠髓源抑制性細(xì)胞(myeloid-derived suppressor cells)凋亡的影響,并探討ERK1/2分子在其中的作用;于Lewis荷瘤小鼠體內(nèi)研究IL-17是否通過調(diào)控MDSCs凋亡而影響腫瘤的生長。方法:(1)通過皮下注射Lewis細(xì)胞構(gòu)建荷瘤小鼠模型,采用免疫磁珠分選技術(shù)(MACS)分離脾臟MDSCs細(xì)胞,常規(guī)培養(yǎng)。經(jīng)IL-17處理后,使用AnnexinV/PI凋亡試劑盒檢測MDSCs凋亡情況,通過Western-blot技術(shù)檢測BCL-2的表達(dá)以及ERK1/2的磷酸化水平。(2)在MDSCs培養(yǎng)體系中加入不同濃度ERK1/2分子磷酸化抑制劑(U0126)預(yù)處理,再經(jīng)IL-17作用,運(yùn)用AnnexinV/PI凋亡試劑盒檢測MDSCs的凋亡情況并通過Western-blot技術(shù)檢測BCL-2的表達(dá)水平。(3)在荷瘤小鼠體內(nèi)腹腔注射IL-17,2.5μg/只/次,共三次。觀察腫瘤生長情況,測量腫瘤重量和大小;通過實時定量PCR(qRT-PCR)技術(shù)檢測核蛋白(Ki67)mRNA、誘導(dǎo)性一氧化氮合酶(iNOS)mRNA的表達(dá)情況。采用流式細(xì)胞術(shù)(FCM)檢測樹突狀細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、CD4+T細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞的比例,免疫熒光技術(shù)(IF)檢測腫瘤組織中MDSCs的浸潤情況。(4)IL-17處理荷瘤小鼠后,通過MACS分選出MDSCs細(xì)胞。運(yùn)用Western-blot技術(shù)檢測細(xì)胞中ERK1/2磷酸化水平。常規(guī)培養(yǎng)后,使用AnnexinV/PI凋亡試劑盒檢測MDSCs的凋亡情況,采用精氨酸酶(ARG-1)試劑盒檢測ARG-1活性,運(yùn)用Western-blot技術(shù)檢測BCL-2表達(dá)水平。(5)IL-17處理荷瘤小鼠后,使用吉西他濱清除荷瘤小鼠體內(nèi)MDSCs,過繼轉(zhuǎn)移經(jīng)U0126處理后的MDSCs(簡稱過繼轉(zhuǎn)移模型)。測量腫瘤體積、重量,采用qRT-PCR檢測腫瘤組織中iNOS mRNA表達(dá)水平,通過MACS分選MDSCs,常規(guī)培養(yǎng),使用AnnexinV/PI凋亡試劑盒檢測MDSCs凋亡情況,使用ARG-1試劑盒檢測ARG-1活性,運(yùn)用Western-blot技術(shù)檢測BCL-2表達(dá)水平。結(jié)果:(1)IL-17處理MDSCs細(xì)胞24h,對照組活細(xì)胞比例為(45.33±1.556)%,il-17處理組為(59.55±2.831)%(p0.001),晚期凋亡細(xì)胞比例對照組為(22.87±1.349)%,il-17處理組為(13.70±1.003)%(p0.01)。western-blot結(jié)果顯示:il-17處理組erk1/2分子磷酸化水平(p0.001)、bcl-2表達(dá)水平都明顯上調(diào)(p0.01)。(2)在mdscs培養(yǎng)體系中加入erk1/2分子磷酸化抑制劑(u0126)預(yù)處理,再加入il-17處理。24h后,當(dāng)u0126濃度為7.5μm時,空白對照組活細(xì)胞比例為(39.08±2.718)%,u0126處理組為(15.57±1.009)%(p0.001),空白對照組晚期凋亡細(xì)胞比例為(8.007±1.777)%,u0126處理組為(26.95±1.179)%(p0.01)。western-blot檢測發(fā)現(xiàn),u0126處理組抗凋亡蛋白bcl-2表達(dá)明顯減少。(3)與pbs對照組相比,il-17處理荷瘤小鼠后,腫瘤生長速度加快(p0.01),腫瘤體積增加[pbs組為2.753±0.7803cm3,il-17處理組為6.000±0.8653cm3)(p0.05)],腫瘤重量增加[pbs組為1.886±0.2020g,il-17處理組為3.480±0.4586g(p0.05)],核蛋白ki67mrna表達(dá)增加(p0.05)。fcm結(jié)果顯示:對照組脾臟中mdscs數(shù)量為(2.187±0.2541)×107、比例為(13.40±0.3606)%,il-17處理組數(shù)量為(3.967±0.1133)×107,比例為(24.43±1.1240)%(p0.001)。if結(jié)果顯示腫瘤組織中mdscs浸潤數(shù)目增加,qrt-pcr檢測發(fā)現(xiàn)腫瘤組織中inosmrna表達(dá)增加(p0.05)。(4)與pbs對照組相比,western-blot檢測發(fā)現(xiàn)經(jīng)il-17處理后的荷瘤小鼠脾臟mdscs中erk1/2磷酸化水平、bcl-2表達(dá)水平明顯上調(diào)(p0.05);arg-1活性明顯增強(qiáng)(p0.05)。體外培養(yǎng)24h后,pbs對照組活細(xì)胞比例為(44.23±3.477)%,il-17處理組為(59.33±2.718)%(p0.05);pbs對照組晚期凋亡細(xì)胞比例為(33.28±4.104)%,il-17處理組為(19.26±2.494)%(p0.05)。(5)與對照組相比,過繼轉(zhuǎn)移經(jīng)u0126處理的mdscs后,脾臟和腫瘤組織中mdscs分別減少了3.6%(p0.05)、5.3%(p0.01),腫瘤體積減小,腫瘤重量減輕(對照組為2.948±0.7537g,u0126處理組為0.7830±0.1597g)(p0.05),腫瘤組織中ki67mrna(p0.01)、inosmrna的相對表達(dá)水平降低(p0.05),脾臟分離出的mdscs經(jīng)培養(yǎng)后,凋亡水平明顯增加,bcl-2表達(dá)量明顯減少(p0.001)。結(jié)論:(1)IL-17在體外能夠通過增強(qiáng)ERK1/2分子的磷酸化抑制MDSCs的凋亡(2)IL-17能通過抑制MDSCs的凋亡和增強(qiáng)其免疫抑制活性促進(jìn)腫瘤的生長。IL-17在荷瘤小鼠體內(nèi)可明顯促進(jìn)腫瘤生長,這種作用與IL-17抑制MDSCs的凋亡有關(guān)。
【關(guān)鍵詞】：白細(xì)胞介素-17 髓源性抑制性細(xì)胞 凋亡 ERK1/2分子
【學(xué)位授予單位】：江蘇大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R73-36
【目錄】：

• 摘要5-8
• ABSTRACT8-14
• 第一章 緒論14-28
• 1.1 MDSCs(myeloid-derived suppressor cells)14-19
• 1.1.1 MDSCs的來源和分群14-15
• 1.1.2 MDSCs的產(chǎn)生15
• 1.1.3 MDSCs的免疫抑制功能及相關(guān)機(jī)制15-16
• 1.1.4 MDSCs與其它細(xì)胞交叉作用16-17
• 1.1.5 MDSCs與疾病的關(guān)系17-19
• 1.2 IL-1719-22
• 1.2.1 IL-17的來源19-20
• 1.2.2 IL-17的調(diào)節(jié)20-21
• 1.2.3 IL-17與疾病的關(guān)系21-22
• 1.3 凋亡22-24
• 1.3.1 凋亡的機(jī)制和作用23-24
• 1.3.2 MDSC的凋亡24
• 1.4 本研究的目的、方法、實驗設(shè)計及意義24-28
• 1.4.1 研究目的24
• 1.4.2 研究方法24-25
• 1.4.3 實驗設(shè)計25-27
• 1.4.4 實驗意義27-28
• 第二章 IL-17在體外對MDSCs凋亡的影響28-41
• 2.1 實驗材料28-30
• 2.1.1 實驗小鼠28
• 2.1.2 主要試劑28-29
• 2.1.3 主要耗材和儀器29-30
• 2.2 實驗方法30-33
• 2.2.1 Lewis荷瘤小鼠模型的建立30
• 2.2.2 小鼠MDSCs分離30-31
• 2.2.3 流式細(xì)胞術(shù)檢測MDSCs凋亡情況31
• 2.2.4 蛋白印跡法檢測MDSCs中BCL-2、ERK1/2、p-ERK1/2 的表達(dá)情況31-33
• 2.2.5 統(tǒng)計學(xué)方法33
• 2.3 實驗結(jié)果33-40
• 2.3.1 IL-17刺激后MDSCs凋亡的變化33-36
• 2.3.2 IL-17 刺激后 MDSCs 中 BCL-2 表達(dá)水平的變化36
• 2.3.3 IL-17刺激MDSCs后ERK1/2 分子表達(dá)水平變化36-40
• 2.4 討論40-41
• 第三章 IL-17在肺癌移植瘤模型中對腫瘤生長和MDSCs數(shù)量的影響41-53
• 3.1 實驗材料41-42
• 3.1.1 實驗小鼠41-42
• 3.1.2 主要試劑42
• 3.1.3 主要儀器42
• 3.2 實驗方法42-46
• 3.2.1 小鼠Lewis肺癌移植瘤模型的建立42-43
• 3.2.2 IL-17處理小鼠Lewis肺癌移植瘤模型43
• 3.2.3 腫瘤生長的檢測、最終體積的測量、腫瘤組織重量的測量43
• 3.2.4 腫瘤細(xì)胞中Ki67mRNA的檢測43-45
• 3.2.5 流式細(xì)胞術(shù)檢測MDSCs比例45
• 3.2.6 免疫熒光檢測MDSCs比例45-46
• 3.2.7 統(tǒng)計學(xué)分析46
• 3.3 實驗結(jié)果46-52
• 3.3.1 腫瘤的發(fā)展進(jìn)程46-47
• 3.3.2 腫瘤大體觀察47
• 3.3.3 腫瘤組織的最終體積47-48
• 3.3.4 腫瘤的重量48
• 3.3.5 Ki67mRNA的檢測48-49
• 3.3.6 腫瘤組織部位MDSCs變化情況49-52
• 3.4 討論52-53
• 第四章 IL-17通過抑制MDSCs凋亡促進(jìn)腫瘤的生長53-60
• 4.1 實驗材料53-54
• 4.1.1 實驗小鼠53
• 4.1.2 主要試劑53-54
• 4.1.3 實驗耗材和儀器54
• 4.2 實驗方法54-55
• 4.2.1 小鼠Lewis肺癌移植瘤模型的建立54
• 4.2.2 小鼠脾細(xì)胞MDSCs分離54-55
• 4.2.3 小鼠脾細(xì)胞MDSCs凋亡的檢測55
• 4.2.4 蛋白印跡法檢測MDSCs中BCL-2、ERK1/2、p-ERK1/2 的表達(dá)情況55
• 4.2.5 統(tǒng)計學(xué)分析55
• 4.3 實驗結(jié)果55-58
• 4.3.1 IL-17小鼠體內(nèi)MDSCs凋亡情況55-57
• 4.3.2 Western-Bot檢測MDSCs中BCL-2 和P-ERK1/2、ERK1/2 蛋白的表達(dá)情況57-58
• 4.4 討論58-60
• 第五章 IL-17通過ERK1/2 分子抑制MDSCs凋亡60-69
• 5.1 實驗材料60-61
• 5.1.1 實驗小鼠60
• 5.1.2 主要試劑60
• 5.1.3 主要耗材和儀器60-61
• 5.2 實驗方法61-62
• 5.2.1 小鼠Lewis肺癌移植瘤模型的建立61
• 5.2.2 小鼠脾細(xì)胞MDSCs分離61
• 5.2.3 小鼠脾細(xì)胞MDSCs凋亡的檢測61
• 5.2.4 蛋白印跡法檢測MDSCs中BCL-2、ERK1/2、p-ERK1/2 的表達(dá)情況61
• 5.2.5 定量PCR檢測腫瘤組織中iNOS表達(dá)水平61
• 5.2.6 MDSCs的清除61-62
• 5.2.7 過繼轉(zhuǎn)移模型的構(gòu)建62
• 5.2.8 精氨酸酶檢測62
• 5.2.9 統(tǒng)計學(xué)分析62
• 5.3 實驗結(jié)果62-67
• 5.3.1 IL-17對ERK1/2 分子抑制后的MDSCs凋亡的影響62-66
• 5.3.2 ERK1/2 分子磷酸化受抑制后的MDSCs對腫瘤生長的影響66-67
• 5.4 討論67-69
• 第六章 結(jié)論與展望69-70
• 6.1 主要結(jié)論69
• 6.2 展望69-70
• 參考文獻(xiàn)70-79
• 致謝79-80
• 攻讀碩士學(xué)位期間發(fā)表的文章80

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本文編號：886295