本文關(guān)鍵詞：低氧誘導的ER應(yīng)激及上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化在人肝細胞癌中作用的初步研究

  更多相關(guān)文章： ER應(yīng)激 上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化 肝細胞癌 低氧誘導因子 糖調(diào)節(jié)蛋白78

【摘要】：內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(Endoplasmic reticulum,ER)是真核細胞最重要的細胞器之一,它是一種由封閉的膜系統(tǒng)以及相互溝通的膜腔而形成的一種網(wǎng)狀結(jié)構(gòu),它參與了蛋白質(zhì)的合成與組裝,分泌與轉(zhuǎn)位等,可以說在細胞生命活動中扮演著重要的角色。當ER中未折疊或者錯誤折疊的蛋白質(zhì)聚集超過了ER負荷時,就會引起其發(fā)生一系列的適應(yīng)性反應(yīng),其中最重要的應(yīng)答反應(yīng)當屬未折疊蛋白反應(yīng)(unfolded protein response,UPR)。作為ER應(yīng)激反應(yīng)最敏感最重要的感應(yīng)器蛋白-糖調(diào)節(jié)蛋白78(Glucose-regulated protein,GRP78),亦被稱為免疫球蛋白重鏈結(jié)合蛋白(Binding immunoglobulin protein,Bi P),首先會與ER膜上的三個跨膜傳感器蛋白IRE1(Inositol-requiring transmembrane kinase/endonuclease 1)、PERK(PKR-like Endoplasmic Reticulum Kinase)以及ATF6(Activating Transcription Factor 6)解離,當這一解離過程完成后,使得原先被Bi P封閉的信號通路激活。PERK活化后會磷酸化真核起始轉(zhuǎn)錄因子e IF2ɑ,導致細胞內(nèi)整體m RNA的轉(zhuǎn)錄翻譯水平明顯降低,同時又會選擇性的增強某些m RNA的轉(zhuǎn)錄翻譯,其中就包括激活轉(zhuǎn)錄因子4(Activating Transcription Factor 4,ATF4)及其下游靶基因CHOP(CCAAT/enhancer binding protein homologous protein);活化的IRE1同時具備激酶和核酸內(nèi)切酶的作用,IRE1自身磷酸化后剪切XBP1(X-box-binding protein 1)的m RNA產(chǎn)生剪切型的s XBP1,使其轉(zhuǎn)變?yōu)榛罨问?活化的IRE1同時募集并5激活應(yīng)激激酶JNK(Jun N-teminal Kinase);此外與Bi P解離的ATF6則迅速轉(zhuǎn)位到高爾基體,被其內(nèi)部的蛋白水解酶剪切成為有活性的轉(zhuǎn)錄因子�？傊甎PR通路的激活的最終目的一方面增強了ER折疊蛋白的能力并通過ER降解部分錯誤折疊蛋白(ER-associated degradation,ERAD),一方面減少蛋白質(zhì)的合成減輕ER負荷,在細胞面對外界刺激如缺氧、低糖/高糖、鈣離子濃度改變、營養(yǎng)缺乏等時促進細胞生存;而當應(yīng)激條件持續(xù)存在則會導致適應(yīng)性反應(yīng)失靈,細胞凋亡程序被啟動。上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(Epithelial-mesenchymal transition,EMT)是指上皮細胞轉(zhuǎn)化為具有間質(zhì)細胞表型的生物學過程,主要特征表現(xiàn)為上皮細胞粘附分子蛋白如鈣黏附蛋白(E-cadherin)表達減少,細胞骨架蛋白轉(zhuǎn)化為波形蛋白(vimentin),最終導致細胞與基底膜的連接作用減弱,細胞本身失去極性,從而獲得了較高的侵襲遷移能力,細胞的抗凋亡能力也相應(yīng)增強,同時產(chǎn)生額外的細胞外基質(zhì)(Extra cellular matrix,ECM)。ER應(yīng)激作為細胞一種適應(yīng)性的反應(yīng)被認為與許多疾病的發(fā)生發(fā)展及預后有著密切的關(guān)系,如神經(jīng)退行性變、病毒所致的感染性疾病以及惡性腫瘤等;而也有越來越多的研究證據(jù)表明EMT使得上皮細胞來源的惡性腫瘤獲得侵襲遷移能力在腫瘤的發(fā)展進程中發(fā)揮了重要的作用。惡性實體腫瘤中時常存在高代謝以及過度增殖的特點,癌巢中通常存在氧供不足,因此本論文的研究目的主要就是探究由低氧誘導的ER應(yīng)激以及EMT在人肝細胞癌中的作用,并通過實驗得到了如下初步的實驗結(jié)果:(1)構(gòu)建了ER應(yīng)激重要的感應(yīng)蛋白Bi P質(zhì)粒并通過western blot以及細胞免疫熒光驗證其在不同細胞株中的表達;(2)通過組織化學染色發(fā)現(xiàn)肝細胞癌組織中ER及EMT均表達上調(diào);(3)低氧刺激誘導的不同肝細胞癌細胞株中ER以及EMT相關(guān)基因上調(diào),并通過半定量PCR以及western blot分別從m RNA水平及蛋白水平得到驗證;(4)在癌組織切片中通過免疫熒光雙標意外發(fā)現(xiàn)Bi P異位表達及與低氧誘導因子(HIF1ɑ)存在共定位的現(xiàn)象;(5)低氧刺激誘導的不同細胞株中觀察到低氧刺激促進Bi P異位入核并與HIF1ɑ表達相關(guān);(6)MTT實驗觀察到低氧刺激的一定時間內(nèi)可以促進細胞存活,說明低氧刺激誘導影響細胞的存活。上述的實驗結(jié)果表明在肝細胞癌中存在ER及EMT,低氧刺激可誘導肝癌細胞ER應(yīng)激及Bi P異位,該結(jié)果提示ER應(yīng)激以及EMT在人肝細胞癌中發(fā)揮了重要的作用。
【關(guān)鍵詞】：ER應(yīng)激 上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化 肝細胞癌 低氧誘導因子 糖調(diào)節(jié)蛋白78
【學位授予單位】：安徽醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R735.7
【目錄】：

• 英文縮略詞表（Abbreviation）7-10
• 中文摘要10-13
• 英文摘要13-16
• 1. 前言16-18
• 2. 實驗材料18-22
• 2.1 細胞株、菌株18
• 2.2 質(zhì)粒18-19
• 2.3 抗體19
• 2.4 主要實驗試劑19
• 2.5 PCR引物的設(shè)計及合成19-20
• 2.6 儀器設(shè)備20-22
• 3. 實驗方法22-41
• 3.1 實驗主要試劑的配制方法22-25
• 3.2 質(zhì)粒小抽25-26
• 3.3 質(zhì)粒大抽26-28
• 3.4 石蠟切片免疫組織化學28-29
• 3.5 石蠟切片免疫熒光29-30
• 3.6 細胞免疫熒光30-31
• 3.7 蛋白質(zhì)免疫印跡（Immune Blot,IB）31-33
• 3.7.1 蛋白樣品的制備31
• 3.7.2 SDS-PAGE的膠的預制31-32
• 3.7.3 蛋白上樣及電泳32
• 3.7.4 轉(zhuǎn)膜32-33
• 3.7.5 孵育抗體及IB檢測33
• 3.8 質(zhì)粒的構(gòu)建33-39
• 3.8.1 引物的設(shè)計33-34
• 3.8.2 細胞RNA的提取34-35
• 3.8.3 擴增目的片段35-36
• 3.8.4 凝膠電泳及膠回收36-37
• 3.8.5 目的片段的酶切及連接37-38
• 3.8.6 轉(zhuǎn)化及搖菌38
• 3.8.7 質(zhì)粒酶切鑒定38-39
• 3.9 細胞核漿蛋白分離39-40
• 3.10細胞培養(yǎng)以及轉(zhuǎn)染40
• 3.11實驗數(shù)據(jù)統(tǒng)計學分析40-41
• 4. 實驗結(jié)果41-63
• 4.1 肝細胞癌組織中ER應(yīng)激感應(yīng)蛋白BiP/GRP78異位表達41-42
• 4.2 低氧刺激誘導肝癌細胞株中BiP/GRP78的異位表達42-46
• 4.3 BiP/GRP78與低氧誘導因子HIF1ɑ在細胞核中共定位表達46-48
• 4.4 BiP/GRP78真核表達質(zhì)粒的構(gòu)建及驗證48-51
• 4.5 肝癌細胞株中低氧誘導ER應(yīng)激相關(guān)蛋白上調(diào)表達51-55
• 4.6 低氧對細胞存活的影響55-56
• 4.7 上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化相關(guān)蛋白在肝癌組織中的表達56-60
• 4.8 低氧刺激誘導ER應(yīng)激及EMT相關(guān)基因mRNA的表達60-63
• 5. 討論63-66
• 5.1 ER應(yīng)激感應(yīng)蛋白BiP/GRP78異位表達63-64
• 5.2 肝癌細胞株中低氧刺激誘導ER應(yīng)激64-65
• 5.3 低氧刺激誘導改變肝癌細胞株EMT相關(guān)蛋白表達水平65-66
• 6. 結(jié)論66
• 7. 參考文獻66-71
• 附錄71-74
• 致謝74-76
• 綜述76-88
• 參考文獻82-88

【共引文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前10條

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2 毛，

本文編號：883522