本文關(guān)鍵詞：檢測(cè)前列腺癌細(xì)胞PC3溶酶體膜通透化模型—pLamp2C-mRFP-EGFP的構(gòu)建

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【摘要】：目的:利用串聯(lián)紅綠熒光蛋白報(bào)告基因標(biāo)記的溶酶體膜蛋白來(lái)檢測(cè)前列腺癌細(xì)胞溶酶體的變化,構(gòu)建靶向溶酶體膜通透化(LMP)的篩選模型,為后續(xù)靶向溶酶體膜通透化的藥物篩選奠定基礎(chǔ)。方法:1.設(shè)計(jì)構(gòu)建串聯(lián)紅綠熒光報(bào)告基因標(biāo)記溶酶體膜蛋白(Lamp2C)的真核表達(dá)載體pLamp2C-mRFP-EGFP、pLamp2C-EGFP-mRFP、pmRFP-EGFP-Lamp2C、pEGFP-mRFP-Lamp2C;2.用不同濃度的鞘氨醇處理細(xì)胞,利用流式細(xì)胞術(shù)和MTT觀察鞘氨醇對(duì)細(xì)胞凋亡和壞死的影響;3.熒光顯微鏡觀察構(gòu)建的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染入PC3細(xì)胞的表達(dá)情況;用LysoTracker Blue孵育標(biāo)記轉(zhuǎn)染后的PC3細(xì)胞,共聚焦顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染的質(zhì)粒與溶酶體共定位情況;用鞘氨醇處理轉(zhuǎn)染后的PC3細(xì)胞,共聚焦顯微鏡觀察加入鞘氨醇前后紅綠熒光的變化。利用Image J軟件定量分析共定位情況和紅綠熒光變化。結(jié)果:1.pLamp2C-mRFP-EGFP、pLamp2C-EGFP-mRFP、pmRFP-EGFP-Lamp2C、pEGFP-mRFP-Lamp2C質(zhì)粒構(gòu)建成功;2.鞘氨醇能誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡;3.四種質(zhì)粒瞬時(shí)轉(zhuǎn)染至PC3細(xì)胞,pLamp2C-mRFP-EGFP轉(zhuǎn)染效果最好,mRFP及EGFP均正常表達(dá);pLamp2C-mRFP-EGFP與溶酶體共定位結(jié)果:皮爾森相關(guān)系數(shù)(Pearson’s correlation coefficient)為0.8362±0.0518;經(jīng)鞘氨醇處理前后,PC3細(xì)胞綠色熒光強(qiáng)度(0.1190±0.0223)比(0.0639±0.0156),明顯減弱(t=14.66,P㩳0.05),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,紅色熒光強(qiáng)度(0.1049±0.0101)比(0.1038±0.0109),無(wú)明顯變化(t=1.136,P㧐0.05),差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)論:成功轉(zhuǎn)染構(gòu)建的pLamp2C-mRFP-EGFP至PC3細(xì)胞溶酶體,經(jīng)鞘氨醇處理后綠色熒光明顯減弱,紅色熒光無(wú)明顯變化,指示PC3細(xì)胞溶酶體膜通透化。
【關(guān)鍵詞】：溶酶體膜通透化 前列腺癌細(xì)胞 鞘氨醇 凋亡
【學(xué)位授予單位】：天津醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類(lèi)號(hào)】：R737.25
【目錄】：

• 中文摘要4-5
• Abstract5-10
• 縮略語(yǔ)/符號(hào)說(shuō)明10-11
• 前言11-13
• 研究現(xiàn)狀、成果11-12
• 研究目的、方法12-13
• 一、構(gòu)建串聯(lián)熒光報(bào)告基因pLamp2C-mRFP-EGFP、pLamp2C-EGFP-mRFP、pmRFP-EGFP-Lamp2C、pEGFP-mRFP-Lamp2C13-39
• 1.1 對(duì)象和方法13-26
• 1.1.1 實(shí)驗(yàn)所需質(zhì)粒13
• 1.1.2 實(shí)驗(yàn)所需主要儀器13-14
• 1.1.3 實(shí)驗(yàn)所需主要試劑14
• 1.1.4 主要溶液配制14-15
• 1.1.5 構(gòu)建串聯(lián)熒光報(bào)告基因pLamp2C-mRFP-EGFP15-21
• 1.1.6 構(gòu)建串聯(lián)熒光報(bào)告基因pLamp2C-EGFP-mRFP21-23
• 1.1.7 構(gòu)建串聯(lián)熒光報(bào)告基因pmRFP-EGFP-Lamp2C23-24
• 1.1.8 構(gòu)建串聯(lián)熒光報(bào)告基因pEGFP-mRFP-Lamp2C24-26
• 1.2 結(jié)果26-37
• 1.2.1 pLamp2C-mRFP-EGFP26-29
• 1.2.2 pLamp2C-EGFP-mRFP29-32
• 1.2.3 pmRFP-EGFP-Lamp2C32-34
• 1.2.4 pEGFP-mRFP-Lamp2C34-37
• 1.3 討論37-38
• 1.4 小結(jié)38-39
• 二、鞘氨醇對(duì)PC3細(xì)胞凋亡和壞死的影響39-48
• 2.1 實(shí)驗(yàn)材料39-41
• 2.1.1 研究對(duì)象39
• 2.1.2 主要的實(shí)驗(yàn)試劑39
• 2.1.3 主要的儀器及實(shí)驗(yàn)設(shè)備39-40
• 2.1.4 試劑的配制方法40-41
• 2.2 實(shí)驗(yàn)方法41-44
• 2.2.1 細(xì)胞復(fù)蘇、培養(yǎng)、傳代、凍存41-42
• 2.2.2 細(xì)胞計(jì)數(shù)42
• 2.2.3 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)凋亡42-43
• 2.2.4 MTT法檢測(cè)細(xì)胞壞死43-44
• 2.3 結(jié)果44-45
• 2.4 討論45-46
• 2.5 小結(jié)46-48
• 三、溶酶體膜通透化對(duì)熒光報(bào)告基因紅、綠熒光蛋白的影響48-65
• 3.1 實(shí)驗(yàn)對(duì)象和材料48-50
• 3.1.1 細(xì)胞48
• 3.1.2 主要的實(shí)驗(yàn)試劑48
• 3.1.3 實(shí)驗(yàn)主要儀器設(shè)備48-49
• 3.1.4 所需主要試劑及溶液配制49-50
• 3.2 實(shí)驗(yàn)方法50-56
• 3.2.1 PC3細(xì)胞復(fù)蘇、培養(yǎng)、傳代、凍存50-51
• 3.2.2 提取質(zhì)粒pLamp2C-mRFP-EGFP、pLamp2C-EGFP-mRFP、pmRFP-EGFP-Lamp2C、pEGFP-mRFP-LAMP2C51-54
• 3.2.3 PC3細(xì)胞轉(zhuǎn)染54-55
• 3.2.4 LysoTracker Blue標(biāo)記溶酶體55
• 3.2.5 利用鞘氨醇誘導(dǎo)溶酶體膜通透化55-56
• 3.2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理56
• 3.3 結(jié)果56-61
• 3.3.1 轉(zhuǎn)染PC3細(xì)胞56
• 3.3.2 pLamp2C-mRFP-EGFP與溶酶體共定位56-58
• 3.3.3 鞘氨醇處理前后pLamp2C-mRFP-EGFP的紅綠熒光變化58-61
• 3.4 討論61-64
• 3.5 小結(jié)64-65
• 結(jié)論65-66
• 參考文獻(xiàn)66-70
• 發(fā)表論文和參加科研情況說(shuō)明70-71
• 綜述 溶酶體膜通透化與細(xì)胞死亡的研究進(jìn)展71-80
• 綜述參考文獻(xiàn)76-80
• 致謝80-81
• 個(gè)人簡(jiǎn)歷81

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本文編號(hào)：878069