本文關(guān)鍵詞：長鏈非編碼RNA分子UCA1介導(dǎo)胃癌多藥耐藥的機制研究

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【摘要】：【背景】胃癌是我國最常見的惡性腫瘤之一,化療是治療中晚期胃癌的重要手段,多藥耐藥是胃癌患者化療失敗的主要原因。腫瘤耐藥機制十分復(fù)雜,既往研究主要集中在僅占基因組2%左右的蛋白編碼基因上,顯然不能根本闡明腫瘤復(fù)雜的耐藥機制。而占基因組98%的非編碼基因在近年來越來越受到人們重視,成為攻克腫瘤耐藥難題的希望所在。非編碼基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生非編碼RNA,包括長鏈非編碼RNA和短鏈非編碼RNA,其中以長鏈非編碼RNA為主要組成部分。長鏈非編碼RNA(long noncoding RNA,lnc RNA)是一類轉(zhuǎn)錄本長度超過200個核苷酸的非編碼RNA分子,其不編碼蛋白,而是以RNA的形式通過多種機制參與基因表達調(diào)控。近年來,lnc RNA已被證實在腫瘤的增殖、轉(zhuǎn)移和耐藥中發(fā)揮了重要調(diào)節(jié)作用,然而目前l(fā)nc RNA在胃癌多藥耐藥中的作用尚不清楚。前期,我們通過高通量表達譜芯片篩選得到了一批在胃癌多藥耐藥細胞差異表達的lnc RNA和mi RNA分子。本研究綜合分析芯片中差異表達的lnc RNA分子,發(fā)現(xiàn)UCA1與胃癌耐藥密切相關(guān),并通過體內(nèi)外實驗驗證了UCA1在胃癌耐藥中的作用。其后,結(jié)合mi RNA芯片數(shù)據(jù)通過生物信息學(xué)分析找到了與UCA1相互作用的mi RNA let-7,并通過分子生物學(xué)實驗闡明了UCA1作為競爭內(nèi)源性RNA通過結(jié)合let-7促進下游靶分子HMGA2表達,進而介導(dǎo)胃癌多藥耐藥的分子機制�！灸康摹�1.篩選和驗證胃癌耐藥相關(guān)lnc RNA分子。2.通過體內(nèi)外實驗研究UCA1對胃癌多藥耐藥的調(diào)節(jié)作用。3.闡明UCA1調(diào)節(jié)胃癌多藥耐藥的分子機制。【方法】1.分析高通量表達譜芯片數(shù)據(jù),篩選差異表達的lnc RNA分子,并通過q RT-PCR驗證候選分子的表達。通過q RT-PCR在不同細胞系和胃癌組織中驗證UCA1的表達。2.MTT實驗驗證UCA1對胃癌多藥耐藥的調(diào)節(jié)作用,流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡。裸鼠皮下移植瘤實驗驗證UCA1對體內(nèi)胃癌細胞化療敏感性的調(diào)節(jié)作用。3.熒光原位雜交和胞漿胞核分離實驗檢測UCA1的細胞內(nèi)定位和分布。4.生物信息學(xué)分析預(yù)測與UCA1結(jié)合的mi RNA和蛋白,雙熒光素酶報告基因?qū)嶒灪蚏IP實驗分別證實UCA1與mi RNA、UCA1與蛋白的相互作用。5.通過q RT-PCR、MTT、流式細胞術(shù)檢測凋亡驗證let-7e和HMGA2在胃癌耐藥細胞的表達及其對胃癌耐藥的調(diào)節(jié)作用。western blot驗證let-7e對靶基因HMGA2的負向調(diào)控關(guān)系。通過western blot和相關(guān)分析驗證UCA1對HMGA2的正向調(diào)節(jié)作用。通過let-7e結(jié)合位點突變證實UCA1調(diào)節(jié)HMGA2表達需要let-7e參與�！窘Y(jié)果】1.高通量芯片篩選獲得19個在兩株胃癌耐藥細胞中上調(diào)表達10倍以上的lnc RNA,q RT-PCR證實UCA1在兩株耐藥細胞系中表達顯著上調(diào)。通過q RT-PCR檢測,還發(fā)現(xiàn)UCA1在白血病耐藥細胞表達上調(diào),在其他消化系腫瘤如胃癌、結(jié)直腸癌、肝癌、食管癌細胞系中,UCA1同樣表達上調(diào)。臨床樣本中檢測UCA1表達水平發(fā)現(xiàn),UCA1在胃癌組織中表達顯著高于配對的癌旁正常組織。2.UCA1可顯著促進胃癌細胞對化療藥ADR、5-FU和CDDP產(chǎn)生耐藥,這種調(diào)節(jié)作用與細胞抗凋亡能力增強相關(guān)。體內(nèi)試驗同樣證實下調(diào)UCA1表達可降低胃癌細胞的化療敏感性。3.熒光原位雜交和胞漿胞核分離實驗證實UCA1主要分布在胞漿,胞核中也有少量分布,提示UCA1主要在轉(zhuǎn)錄后水平發(fā)揮調(diào)節(jié)作用。4.Reg RNA、PITA和FINDTAR3數(shù)據(jù)庫預(yù)測發(fā)現(xiàn)UCA1全長序列包含let-7家族mi RNA結(jié)合位點,其中以let-7e結(jié)合位點評分最高。Lnc RNAtor數(shù)據(jù)庫預(yù)測發(fā)現(xiàn)UCA1可與AGO2蛋白結(jié)合。RIP實驗證實,相對于對照Ig G抗體,抗AGO2抗體可顯著富集AGO2-UCA1復(fù)合物,表明UCA1可與AGO2蛋白結(jié)合。Let-7e可降低UCA1雙熒光素酶報告基因的熒光素信號強度,UCA1上let-7e結(jié)合位點突變可部分抑制這一效應(yīng),表明UCA1可與let-7e直接結(jié)合。以上結(jié)果表明UCA1可作為競爭內(nèi)源性RNA,通過結(jié)合let-7發(fā)揮轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)作用。5.HMGA2是let-7已驗證的下游靶分子。let-7e在胃癌耐藥細胞表達降低,HMGA2在胃癌耐藥細胞表達升高。過表達let-7e或干擾HMGA2可降低胃癌耐藥細胞對ADR、5-FU和CDDP的IC50,同時化療藥物誘導(dǎo)的細胞凋亡增加。Let-7e可以負向調(diào)控HMGA2蛋白表達,證實HMGA2是let-7e的下游靶分子。UCA1可以正向調(diào)控HMGA2蛋白表達,相關(guān)分析表明二者表達呈正相關(guān)。UCA1促進HMGA2表達依賴于結(jié)合let-7,let-7結(jié)合位點突變可抑制這一效應(yīng)。【結(jié)論】UCA1在胃癌耐藥細胞、多種消化系腫瘤細胞及胃癌組織中表達上調(diào),是重要的耐藥相關(guān)基因和促癌因子。上調(diào)UCA1可促進體內(nèi)、體外胃癌細胞的多藥耐藥性。UCA1作為競爭內(nèi)源性RNA,通過結(jié)合let-7(尤其是let-7e),降低let-7對耐藥相關(guān)基因HMGA2的抑制作用,HMGA2表達升高,通過抗凋亡作用促進胃癌細胞的多藥耐藥性。綜上所述,本研究以競爭內(nèi)源性RNA理論作為橋梁,將胃癌耐藥lnc RNA表達譜和mi RNA表達譜數(shù)據(jù)整合分析,從非編碼RNA相互作用角度闡示了UCA1-let-7-HMGA2通路在胃癌多藥耐藥中的調(diào)節(jié)作用,可望為逆轉(zhuǎn)胃癌多藥耐藥提供新的分子靶點。
【關(guān)鍵詞】：胃癌 多藥耐藥 長鏈非編碼RNA 競爭內(nèi)源性RNA 尿路上皮癌相關(guān)轉(zhuǎn)錄本1
【學(xué)位授予單位】：第四軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R735.2
【目錄】：

• 縮略語表5-9
• 中文摘要9-12
• 英文摘要12-16
• 前言16-17
• 文獻回顧17-36
• 第一部分 長鏈非編碼RNA芯片篩選及UCA1的表達驗證36-47
• 引言36
• 1 材料36-37
• 1.1 細胞系36-37
• 1.2 主要試劑37
• 1.3 主要儀器37
• 2 方法37-40
• 2.1 細胞培養(yǎng)37-38
• 2.2 Trizol法提取細胞總RNA38
• 2.3 q RT-PCR驗證lnc RNA的表達38-40
• 3 結(jié)果40-45
• 4 討論45-47
• 第二部分 Lnc RNA UCA1對胃癌多藥耐藥的調(diào)節(jié)作用47-57
• 引言47
• 1 材料47-49
• 1.1 細胞系47
• 1.2 主要試劑47-49
• 1.3 主要儀器49
• 2 方法49-51
• 2.1 細胞培養(yǎng)49
• 2.2 X-treme GENE轉(zhuǎn)染試劑轉(zhuǎn)染si RNA或質(zhì)粒49-50
• 2.3 慢病毒穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞系的構(gòu)建50
• 2.4 q RT-PCR檢測UCA1的表達50
• 2.5 MTT法檢測細胞體外藥物敏感性50
• 2.6 流式細胞儀檢測細胞凋亡50-51
• 2.7 裸鼠皮下移植瘤模型觀察腫瘤的體內(nèi)藥物敏感性51
• 3 結(jié)果51-56
• 3.1 穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞系的建立51-52
• 3.2 UCA1對胃癌細胞耐藥性的影響52-53
• 3.3 UCA1對胃癌細胞凋亡的調(diào)節(jié)53-55
• 3.4 體內(nèi)實驗驗證UCA1對胃癌細胞耐藥的影響55-56
• 4 討論56-57
• 第三部分 UCA1作為ce RNA促進胃癌耐藥的機制研究57-76
• 引言57
• 1 材料57-59
• 1.1 細胞系57
• 1.2 主要試劑57-59
• 1.3 主要儀器59
• 2 方法59-65
• 2.1 原位雜交檢測胃癌細胞內(nèi)UCA1表達59-60
• 2.2 胞核胞漿RNA分離60
• 2.3 細胞mi RNA提取與q RT-PCR檢測mi RNA表達60-62
• 2.4 Western blot 檢測蛋白表達62
• 2.5 RNA結(jié)合蛋白免疫共沉淀（RIP）62-64
• 2.6 雙熒光素酶報告基因?qū)嶒?/span>64-65
• 3 結(jié)果65-73
• 3.1 UCA1的細胞內(nèi)定位研究65-67
• 3.2 UCA1與mi RNA、蛋白相互作用的生物信息學(xué)預(yù)測67-68
• 3.3 UCA1與AGO2、let-7e相互作用的的實驗驗證68-70
• 3.4 let-7 及HMGA2的表達功能驗證和let-7 下游靶分子驗證70-72
• 3.5 UCA1與HMGA2的相關(guān)分析及UCA1對HMGA2的表達調(diào)控驗證72-73
• 4 討論73-76
• 小結(jié)76-77
• 參考文獻77-90
• 附錄90-91
• 個人簡歷和研究成果91-92
• 致謝92-93

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本文編號：877807