本文關(guān)鍵詞：巨噬細胞極化微環(huán)境促肺癌發(fā)生與藥物治療

  更多相關(guān)文章： 巨噬細胞極化 微環(huán)境 肺癌 自噬 新生血管形成

【摘要】：腫瘤的惡性進展與巨噬細胞極化微環(huán)境密切相關(guān)。在腫瘤的形成中,極化的M2型巨噬細胞創(chuàng)造了一種炎性環(huán)境促進腫瘤生長。然而,巨噬細胞極化微環(huán)境與腫瘤進展是否有直接關(guān)系,至今尚無定論。因此,明確巨噬細胞極化微環(huán)境促進腫瘤發(fā)展的機制對腫瘤治療甚為關(guān)鍵。本課題以肺癌為研究對象,目的是研究巨噬細胞極化微環(huán)境對肺癌的促進及藥物治療,以期為肺癌防治提供有效措施。本研究首先考察體外巨噬細胞極化微環(huán)境對LLC細胞是否有直接影響,采用小鼠腹腔巨噬細胞(PEMs),用LPS(10 ng/ml)將PEMs極化為M1型巨噬細胞;用IL-4(10 ng/ml)誘導(dǎo)PEMs為M2型巨噬細胞;通過熒光雙染法檢測極化的巨噬細胞與LLC細胞共培養(yǎng);MTT法和PCNA免疫熒光法檢測巨噬細胞條件培養(yǎng)基對LLC細胞增殖影響;細胞劃痕實驗、Transwell實驗分析巨噬細胞條件培養(yǎng)基對LLC細胞遷移、侵襲的關(guān)系。此外,本課題還研究了體外巨噬細胞極化微環(huán)境對新生血管生成的影響,MTT法和PCNA免疫熒光法檢測巨噬細胞條件培養(yǎng)基對人臍靜脈內(nèi)皮細胞(HUVEC)的促增殖作用;伊文斯蘭滲出法檢測HUVEC細胞體外通透性;雞胚尿囊膜(CAM)模型研究巨噬細胞條件培養(yǎng)基對新生血管形成的影響。接著,為探索巨噬細胞極化微環(huán)境促癌機制,我們用AO/EB熒光雙染法檢測細胞凋亡;免疫熒光法檢測自噬相關(guān)蛋白LC3-B、P62表達;DQ-Green BSA降解實驗觀察細胞溶酶體活性;DAF-2 DA和DCF-DA分別檢測細胞內(nèi)NO和ROS。最后,我們建立烏拉坦誘導(dǎo)的小鼠肺癌模型,流式細胞術(shù)和Western Blot檢測肺癌小鼠肺泡細胞中巨噬細胞表型;ELISA試劑盒檢測肺癌小鼠血清中5-HIAA和肺泡灌洗液中IFN-γ、IL-12、TNF-α、TGF-β、IL-10、IL-4含量;免疫組化法檢測小鼠肺組織中LC3-B、P62和CD31蛋白的表達;伊文斯蘭滲出法檢測肺血管通透性。另外,為充分證明巨噬細胞極化微環(huán)境促進肺癌發(fā)生的機制,我們使用巨噬細胞耗竭劑、自噬抑制劑和血管保護劑治療肺癌小鼠,觀察其對肺癌發(fā)生的阻止作用。本文結(jié)果表明,M1型巨噬細胞對LLC細胞吞噬能力明顯比極化前強,而M2型巨噬細胞對LLC細胞吞噬能力明顯比極化前弱。極化的M1型和M2型巨噬細胞條件培養(yǎng)基對LLC細胞增殖、遷移、侵襲無明顯影響,然而,我們意外的發(fā)現(xiàn)M2型巨噬細胞條件化培養(yǎng)基能促進體外HUVEC的增殖、增加HUVEC細胞體外通透性、誘導(dǎo)雞胚尿囊膜(CAM)新生血管形成,而M1型巨噬細胞條件化培養(yǎng)基對此沒有影響。機制研究顯示,1%血清饑餓條件下,M2型巨噬細胞條件培養(yǎng)基明顯增加HUVEC細胞自噬小體及LC3-B蛋白表達,但減少自噬底物P62蛋白和DQ-Green BSA的降解,而自噬抑制劑氯喹在不影響HUVEC細胞增殖濃度下降低HUVEC通透性。此外,我們也發(fā)現(xiàn),M2型巨噬細胞條件化培養(yǎng)基可以增加HUVEC細胞內(nèi)NO和ROS水平,使用氯喹抑制自噬后可降低細胞內(nèi)NO和ROS水平。最后,我們在體內(nèi)實驗中觀察到烏拉坦誘導(dǎo)的小鼠肺癌增加肺泡M2型巨噬細胞比例,促進肺組織LC3-B表達,抑制P62蛋白降解。同時,烏拉坦誘導(dǎo)的小鼠肺癌促進新生血管標志物CD31蛋白表達、增加血清血管紊亂標志物5-HIAA水平、提高肺血管通透性。氯屈膦酸鈉脂質(zhì)體誘導(dǎo)的M2型巨噬細胞耗竭、氯喹誘導(dǎo)的自噬抑制和丹酚酸B誘導(dǎo)的血管保護均可明顯減少小鼠肺部腫瘤數(shù)、CD31蛋白表達、5-HIAA水平和肺血管通透性,降低新生血管異常和肺癌發(fā)生率。綜上所述,M2型巨噬細胞微環(huán)境促進肺癌發(fā)展的機制不是直接刺激腫瘤增殖,而是通過誘導(dǎo)自噬性新生血管形成促進肺癌的發(fā)展。抑制M2型巨噬細胞生成、減少自噬或保護血管均可成為有前景的肺癌防治措施。
【關(guān)鍵詞】：巨噬細胞極化 微環(huán)境 肺癌 自噬 新生血管形成
【學(xué)位授予單位】：河南大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R734.2
【目錄】：

• 摘要4-6
• ABSTRACT6-12
• Abbreviation12-14
• 第一部分 緒論14-20
• 1.1 肺癌的研究現(xiàn)狀14
• 1.2 巨噬細胞與肺癌的發(fā)生14-15
• 1.3 新生血管與腫瘤的進展15-17
• 1.4 自噬與肺癌的惡化17-20
• 第二部分 巨噬細胞極化對LLC細胞作用研究20-36
• 2.1 前言20-21
• 2.2 實驗材料21-23
• 2.2.1 試劑材料21
• 2.2.2 試劑配制21-22
• 2.2.3 實驗細胞22-23
• 2.2.4 實驗動物23
• 2.2.5 主要儀器23
• 2.3 實驗方法23-26
• 2.3.1 腹腔巨噬細胞分離與純化23
• 2.3.2 巨噬細胞極化及收集巨噬細胞極化條件培養(yǎng)基23-24
• 2.3.3 流式細胞術(shù)（FCM）檢測巨噬細胞表型24
• 2.3.4 巨噬細胞吞噬LLC細胞實驗24
• 2.3.5 MTT法檢測細胞增殖實驗24-25
• 2.3.6 PCNA免疫熒光法檢測細胞增殖實驗25
• 2.3.7 細胞劃痕實驗25
• 2.3.8 Transwell實驗25-26
• 2.3.9 統(tǒng)計學(xué)分析26
• 2.4 實驗結(jié)果26-34
• 2.4.1 小鼠腹腔巨噬細胞誘導(dǎo)前后形態(tài)變化26
• 2.4.2 巨噬細胞極化26-27
• 2.4.3 巨噬細胞吞噬LLC細胞實驗27-28
• 2.4.4 巨噬細胞極化條件培養(yǎng)基對LLC細胞增殖的影響28-31
• 2.4.5 巨噬細胞極化條件培養(yǎng)基對LLC細胞遷移能力的影響31-32
• 2.4.6 巨噬細胞極化條件培養(yǎng)基對LLC細胞侵襲能力的影響32-34
• 2.5 實驗小結(jié)34-36
• 第三部分 巨噬細胞極化對體外新生血管的影響36-42
• 3.1 前言36
• 3.2 實驗材料36-37
• 3.2.1 試劑材料36
• 3.2.2 實驗動物36-37
• 3.2.3 實驗細胞37
• 3.2.4 實驗儀器37
• 3.3 實驗方法37-38
• 3.3.1 MTT法檢測HUVEC細胞增殖37
• 3.3.2 PCNA免疫熒光法檢測HUVEC細胞增殖37
• 3.3.3 伊文斯蘭滲出法檢測HUVEC細胞通透性37
• 3.3.4 雞胚尿囊膜（CAM）法檢測巨噬細胞對體外血管生成的影響37-38
• 3.3.5 統(tǒng)計學(xué)分析38
• 3.4 實驗結(jié)果38-41
• 3.4.1 巨噬細胞極化對HUVEC細胞增殖的影響38-39
• 3.4.2 伊文斯蘭滲出法檢測HUVEC細胞體外通透性39-40
• 3.4.3 雞胚尿囊膜實驗檢測巨噬細胞對新生血管的影響40-41
• 3.5 實驗小結(jié)41-42
• 第四部分 巨噬細胞極化對HUVEC細胞自噬的影響42-58
• 4.1 前言42-43
• 4.2 實驗材料43
• 4.2.1 實驗試劑43
• 4.2.2 實驗細胞43
• 4.2.3 實驗儀器43
• 4.3 實驗方法43-45
• 4.3.1 AO染色檢測HUVEC細胞自噬小體形成43-44
• 4.3.2 免疫熒光檢測HUVEC自噬相關(guān)蛋白表達44
• 4.3.3 DQ-Green BSA檢測溶酶體活性44
• 4.3.4 HUVEC細胞中NO含量檢測44-45
• 4.3.5 HUVEC細胞中ROS含量檢測45
• 4.3.6 AO/EB染色檢測HUVEC細胞凋亡45
• 4.4 實驗結(jié)果45-56
• 4.4.1 AO染色檢測HUVEC細胞自噬小體形成45-47
• 4.4.2 LC3-B蛋白形成檢測47-48
• 4.4.3 P62蛋白降解檢測48-50
• 4.4.4 DQ-Green BSA檢測自噬降解情況50-51
• 4.4.5 AO/EB檢測HUVEC細胞凋亡51-53
• 4.4.6 DAF-2DA檢測HUVEC細胞NO生成53-54
• 4.4.7 DCF-DA檢測HUVEC細胞內(nèi)ROS生成54-56
• 4.5 實驗小結(jié)56-58
• 第五部分 巨噬細胞對體內(nèi)肺癌模型發(fā)展的影響58-78
• 5.1 前言58-59
• 5.2 實驗材料59-61
• 5.2.1 實驗試劑59
• 5.2.2 實驗試劑配制59-60
• 5.2.3 實驗動物60
• 5.2.4 實驗儀器60-61
• 5.3 實驗方法61-66
• 5.3.1 小鼠肺組織中巨噬細胞表型檢測61-62
• 5.3.2 肺癌組織HE染色62-63
• 5.3.3 免疫組化法檢測肺組織中P62、LC3-B、CD31蛋白表達63-64
• 5.3.4 Western Blot方法64-66
• 5.4 實驗結(jié)果66-77
• 5.4.1 烏拉坦誘導(dǎo)對小鼠體征的影響66-68
• 5.4.2 烏拉坦誘導(dǎo)對小鼠血清中 5-HIAA水平的影響68
• 5.4.3 烏拉坦誘導(dǎo)對小鼠肺泡細胞中巨噬細胞表型的影響68-70
• 5.4.4 藥物干預(yù)對烏拉坦誘導(dǎo)的小鼠肺癌模型的病理特征的影響70-71
• 5.4.5 烏拉坦誘導(dǎo)對小鼠肺組織自噬相關(guān)蛋白表達的影響71-72
• 5.4.6 藥物干預(yù)對烏拉坦誘導(dǎo)小鼠肺新生血管的影響72-74
• 5.4.7 藥物干預(yù)對烏拉坦誘導(dǎo)小鼠肺血管通透性的影響74
• 5.4.8 藥物干預(yù)對烏拉坦誘導(dǎo)小鼠肺重量和腫瘤數(shù)的影響74-77
• 5.5 實驗小結(jié)77-78
• 第六部分 討論78-80
• 第七部分 實驗結(jié)論80-82
• 第八部分 論文創(chuàng)新點82-84
• 參考文獻84-92
• 致謝92-94
• 攻讀學(xué)位期間發(fā)表的學(xué)術(shù)論文目錄94-95

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