發(fā)布時(shí)間：2017-09-18 08:45

  本文關(guān)鍵詞：巨噬細(xì)胞極化微環(huán)境促肺癌發(fā)生與藥物治療

  更多相關(guān)文章： 巨噬細(xì)胞極化 微環(huán)境 肺癌 自噬 新生血管形成

【摘要】：腫瘤的惡性進(jìn)展與巨噬細(xì)胞極化微環(huán)境密切相關(guān)。在腫瘤的形成中,極化的M2型巨噬細(xì)胞創(chuàng)造了一種炎性環(huán)境促進(jìn)腫瘤生長。然而,巨噬細(xì)胞極化微環(huán)境與腫瘤進(jìn)展是否有直接關(guān)系,至今尚無定論。因此,明確巨噬細(xì)胞極化微環(huán)境促進(jìn)腫瘤發(fā)展的機(jī)制對(duì)腫瘤治療甚為關(guān)鍵。本課題以肺癌為研究對(duì)象,目的是研究巨噬細(xì)胞極化微環(huán)境對(duì)肺癌的促進(jìn)及藥物治療,以期為肺癌防治提供有效措施。本研究首先考察體外巨噬細(xì)胞極化微環(huán)境對(duì)LLC細(xì)胞是否有直接影響,采用小鼠腹腔巨噬細(xì)胞(PEMs),用LPS(10 ng/ml)將PEMs極化為M1型巨噬細(xì)胞;用IL-4(10 ng/ml)誘導(dǎo)PEMs為M2型巨噬細(xì)胞;通過熒光雙染法檢測(cè)極化的巨噬細(xì)胞與LLC細(xì)胞共培養(yǎng);MTT法和PCNA免疫熒光法檢測(cè)巨噬細(xì)胞條件培養(yǎng)基對(duì)LLC細(xì)胞增殖影響;細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)、Transwell實(shí)驗(yàn)分析巨噬細(xì)胞條件培養(yǎng)基對(duì)LLC細(xì)胞遷移、侵襲的關(guān)系。此外,本課題還研究了體外巨噬細(xì)胞極化微環(huán)境對(duì)新生血管生成的影響,MTT法和PCNA免疫熒光法檢測(cè)巨噬細(xì)胞條件培養(yǎng)基對(duì)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)的促增殖作用;伊文斯蘭滲出法檢測(cè)HUVEC細(xì)胞體外通透性;雞胚尿囊膜(CAM)模型研究巨噬細(xì)胞條件培養(yǎng)基對(duì)新生血管形成的影響。接著,為探索巨噬細(xì)胞極化微環(huán)境促癌機(jī)制,我們用AO/EB熒光雙染法檢測(cè)細(xì)胞凋亡;免疫熒光法檢測(cè)自噬相關(guān)蛋白LC3-B、P62表達(dá);DQ-Green BSA降解實(shí)驗(yàn)觀察細(xì)胞溶酶體活性;DAF-2 DA和DCF-DA分別檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)NO和ROS。最后,我們建立烏拉坦誘導(dǎo)的小鼠肺癌模型,流式細(xì)胞術(shù)和Western Blot檢測(cè)肺癌小鼠肺泡細(xì)胞中巨噬細(xì)胞表型;ELISA試劑盒檢測(cè)肺癌小鼠血清中5-HIAA和肺泡灌洗液中IFN-γ、IL-12、TNF-α、TGF-β、IL-10、IL-4含量;免疫組化法檢測(cè)小鼠肺組織中LC3-B、P62和CD31蛋白的表達(dá);伊文斯蘭滲出法檢測(cè)肺血管通透性。另外,為充分證明巨噬細(xì)胞極化微環(huán)境促進(jìn)肺癌發(fā)生的機(jī)制,我們使用巨噬細(xì)胞耗竭劑、自噬抑制劑和血管保護(hù)劑治療肺癌小鼠,觀察其對(duì)肺癌發(fā)生的阻止作用。本文結(jié)果表明,M1型巨噬細(xì)胞對(duì)LLC細(xì)胞吞噬能力明顯比極化前強(qiáng),而M2型巨噬細(xì)胞對(duì)LLC細(xì)胞吞噬能力明顯比極化前弱。極化的M1型和M2型巨噬細(xì)胞條件培養(yǎng)基對(duì)LLC細(xì)胞增殖、遷移、侵襲無明顯影響,然而,我們意外的發(fā)現(xiàn)M2型巨噬細(xì)胞條件化培養(yǎng)基能促進(jìn)體外HUVEC的增殖、增加HUVEC細(xì)胞體外通透性、誘導(dǎo)雞胚尿囊膜(CAM)新生血管形成,而M1型巨噬細(xì)胞條件化培養(yǎng)基對(duì)此沒有影響。機(jī)制研究顯示,1%血清饑餓條件下,M2型巨噬細(xì)胞條件培養(yǎng)基明顯增加HUVEC細(xì)胞自噬小體及LC3-B蛋白表達(dá),但減少自噬底物P62蛋白和DQ-Green BSA的降解,而自噬抑制劑氯喹在不影響HUVEC細(xì)胞增殖濃度下降低HUVEC通透性。此外,我們也發(fā)現(xiàn),M2型巨噬細(xì)胞條件化培養(yǎng)基可以增加HUVEC細(xì)胞內(nèi)NO和ROS水平,使用氯喹抑制自噬后可降低細(xì)胞內(nèi)NO和ROS水平。最后,我們?cè)隗w內(nèi)實(shí)驗(yàn)中觀察到烏拉坦誘導(dǎo)的小鼠肺癌增加肺泡M2型巨噬細(xì)胞比例,促進(jìn)肺組織LC3-B表達(dá),抑制P62蛋白降解。同時(shí),烏拉坦誘導(dǎo)的小鼠肺癌促進(jìn)新生血管標(biāo)志物CD31蛋白表達(dá)、增加血清血管紊亂標(biāo)志物5-HIAA水平、提高肺血管通透性。氯屈膦酸鈉脂質(zhì)體誘導(dǎo)的M2型巨噬細(xì)胞耗竭、氯喹誘導(dǎo)的自噬抑制和丹酚酸B誘導(dǎo)的血管保護(hù)均可明顯減少小鼠肺部腫瘤數(shù)、CD31蛋白表達(dá)、5-HIAA水平和肺血管通透性,降低新生血管異常和肺癌發(fā)生率。綜上所述,M2型巨噬細(xì)胞微環(huán)境促進(jìn)肺癌發(fā)展的機(jī)制不是直接刺激腫瘤增殖,而是通過誘導(dǎo)自噬性新生血管形成促進(jìn)肺癌的發(fā)展。抑制M2型巨噬細(xì)胞生成、減少自噬或保護(hù)血管均可成為有前景的肺癌防治措施。
【關(guān)鍵詞】：巨噬細(xì)胞極化 微環(huán)境 肺癌 自噬 新生血管形成
【學(xué)位授予單位】：河南大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R734.2
【目錄】：

• 摘要4-6
• ABSTRACT6-12
• Abbreviation12-14
• 第一部分 緒論14-20
• 1.1 肺癌的研究現(xiàn)狀14
• 1.2 巨噬細(xì)胞與肺癌的發(fā)生14-15
• 1.3 新生血管與腫瘤的進(jìn)展15-17
• 1.4 自噬與肺癌的惡化17-20
• 第二部分 巨噬細(xì)胞極化對(duì)LLC細(xì)胞作用研究20-36
• 2.1 前言20-21
• 2.2 實(shí)驗(yàn)材料21-23
• 2.2.1 試劑材料21
• 2.2.2 試劑配制21-22
• 2.2.3 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞22-23
• 2.2.4 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物23
• 2.2.5 主要儀器23
• 2.3 實(shí)驗(yàn)方法23-26
• 2.3.1 腹腔巨噬細(xì)胞分離與純化23
• 2.3.2 巨噬細(xì)胞極化及收集巨噬細(xì)胞極化條件培養(yǎng)基23-24
• 2.3.3 流式細(xì)胞術(shù)（FCM）檢測(cè)巨噬細(xì)胞表型24
• 2.3.4 巨噬細(xì)胞吞噬LLC細(xì)胞實(shí)驗(yàn)24
• 2.3.5 MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)24-25
• 2.3.6 PCNA免疫熒光法檢測(cè)細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)25
• 2.3.7 細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)25
• 2.3.8 Transwell實(shí)驗(yàn)25-26
• 2.3.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析26
• 2.4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果26-34
• 2.4.1 小鼠腹腔巨噬細(xì)胞誘導(dǎo)前后形態(tài)變化26
• 2.4.2 巨噬細(xì)胞極化26-27
• 2.4.3 巨噬細(xì)胞吞噬LLC細(xì)胞實(shí)驗(yàn)27-28
• 2.4.4 巨噬細(xì)胞極化條件培養(yǎng)基對(duì)LLC細(xì)胞增殖的影響28-31
• 2.4.5 巨噬細(xì)胞極化條件培養(yǎng)基對(duì)LLC細(xì)胞遷移能力的影響31-32
• 2.4.6 巨噬細(xì)胞極化條件培養(yǎng)基對(duì)LLC細(xì)胞侵襲能力的影響32-34
• 2.5 實(shí)驗(yàn)小結(jié)34-36
• 第三部分 巨噬細(xì)胞極化對(duì)體外新生血管的影響36-42
• 3.1 前言36
• 3.2 實(shí)驗(yàn)材料36-37
• 3.2.1 試劑材料36
• 3.2.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物36-37
• 3.2.3 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞37
• 3.2.4 實(shí)驗(yàn)儀器37
• 3.3 實(shí)驗(yàn)方法37-38
• 3.3.1 MTT法檢測(cè)HUVEC細(xì)胞增殖37
• 3.3.2 PCNA免疫熒光法檢測(cè)HUVEC細(xì)胞增殖37
• 3.3.3 伊文斯蘭滲出法檢測(cè)HUVEC細(xì)胞通透性37
• 3.3.4 雞胚尿囊膜（CAM）法檢測(cè)巨噬細(xì)胞對(duì)體外血管生成的影響37-38
• 3.3.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析38
• 3.4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果38-41
• 3.4.1 巨噬細(xì)胞極化對(duì)HUVEC細(xì)胞增殖的影響38-39
• 3.4.2 伊文斯蘭滲出法檢測(cè)HUVEC細(xì)胞體外通透性39-40
• 3.4.3 雞胚尿囊膜實(shí)驗(yàn)檢測(cè)巨噬細(xì)胞對(duì)新生血管的影響40-41
• 3.5 實(shí)驗(yàn)小結(jié)41-42
• 第四部分 巨噬細(xì)胞極化對(duì)HUVEC細(xì)胞自噬的影響42-58
• 4.1 前言42-43
• 4.2 實(shí)驗(yàn)材料43
• 4.2.1 實(shí)驗(yàn)試劑43
• 4.2.2 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞43
• 4.2.3 實(shí)驗(yàn)儀器43
• 4.3 實(shí)驗(yàn)方法43-45
• 4.3.1 AO染色檢測(cè)HUVEC細(xì)胞自噬小體形成43-44
• 4.3.2 免疫熒光檢測(cè)HUVEC自噬相關(guān)蛋白表達(dá)44
• 4.3.3 DQ-Green BSA檢測(cè)溶酶體活性44
• 4.3.4 HUVEC細(xì)胞中NO含量檢測(cè)44-45
• 4.3.5 HUVEC細(xì)胞中ROS含量檢測(cè)45
• 4.3.6 AO/EB染色檢測(cè)HUVEC細(xì)胞凋亡45
• 4.4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果45-56
• 4.4.1 AO染色檢測(cè)HUVEC細(xì)胞自噬小體形成45-47
• 4.4.2 LC3-B蛋白形成檢測(cè)47-48
• 4.4.3 P62蛋白降解檢測(cè)48-50
• 4.4.4 DQ-Green BSA檢測(cè)自噬降解情況50-51
• 4.4.5 AO/EB檢測(cè)HUVEC細(xì)胞凋亡51-53
• 4.4.6 DAF-2DA檢測(cè)HUVEC細(xì)胞NO生成53-54
• 4.4.7 DCF-DA檢測(cè)HUVEC細(xì)胞內(nèi)ROS生成54-56
• 4.5 實(shí)驗(yàn)小結(jié)56-58
• 第五部分 巨噬細(xì)胞對(duì)體內(nèi)肺癌模型發(fā)展的影響58-78
• 5.1 前言58-59
• 5.2 實(shí)驗(yàn)材料59-61
• 5.2.1 實(shí)驗(yàn)試劑59
• 5.2.2 實(shí)驗(yàn)試劑配制59-60
• 5.2.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物60
• 5.2.4 實(shí)驗(yàn)儀器60-61
• 5.3 實(shí)驗(yàn)方法61-66
• 5.3.1 小鼠肺組織中巨噬細(xì)胞表型檢測(cè)61-62
• 5.3.2 肺癌組織HE染色62-63
• 5.3.3 免疫組化法檢測(cè)肺組織中P62、LC3-B、CD31蛋白表達(dá)63-64
• 5.3.4 Western Blot方法64-66
• 5.4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果66-77
• 5.4.1 烏拉坦誘導(dǎo)對(duì)小鼠體征的影響66-68
• 5.4.2 烏拉坦誘導(dǎo)對(duì)小鼠血清中 5-HIAA水平的影響68
• 5.4.3 烏拉坦誘導(dǎo)對(duì)小鼠肺泡細(xì)胞中巨噬細(xì)胞表型的影響68-70
• 5.4.4 藥物干預(yù)對(duì)烏拉坦誘導(dǎo)的小鼠肺癌模型的病理特征的影響70-71
• 5.4.5 烏拉坦誘導(dǎo)對(duì)小鼠肺組織自噬相關(guān)蛋白表達(dá)的影響71-72
• 5.4.6 藥物干預(yù)對(duì)烏拉坦誘導(dǎo)小鼠肺新生血管的影響72-74
• 5.4.7 藥物干預(yù)對(duì)烏拉坦誘導(dǎo)小鼠肺血管通透性的影響74
• 5.4.8 藥物干預(yù)對(duì)烏拉坦誘導(dǎo)小鼠肺重量和腫瘤數(shù)的影響74-77
• 5.5 實(shí)驗(yàn)小結(jié)77-78
• 第六部分 討論78-80
• 第七部分 實(shí)驗(yàn)結(jié)論80-82
• 第八部分 論文創(chuàng)新點(diǎn)82-84
• 參考文獻(xiàn)84-92
• 致謝92-94
• 攻讀學(xué)位期間發(fā)表的學(xué)術(shù)論文目錄94-95

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1 張譯丹;鹽皮質(zhì)激素受體拮抗劑調(diào)控巨噬細(xì)胞表型對(duì)實(shí)驗(yàn)性矽肺的作用[D];河北醫(yī)科大學(xué);2015年

2 盧文冉;HCV core蛋白作用的巨噬細(xì)胞培養(yǎng)上清對(duì)肝細(xì)胞生物學(xué)性狀的影響[D];河北醫(yī)科大學(xué);2015年

3 李文建;載脂蛋白E影響巨噬細(xì)胞因子表達(dá)及分型的機(jī)制研究[D];河北醫(yī)科大學(xué);2015年

4 曹爽;高糖對(duì)巨噬細(xì)胞TLR4信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的調(diào)節(jié)作用[D];河北醫(yī)科大學(xué);2015年

5 寧程程;腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞在子宮內(nèi)膜癌雌激素敏感性中的作用及機(jī)制研究[D];復(fù)旦大學(xué);2014年

6 高龍;PLD4在腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞抑制結(jié)腸癌增殖中的作用研究[D];成都醫(yī)學(xué)院;2015年

7 丁弋娜;TLR4在肺癌相關(guān)巨噬細(xì)胞極性轉(zhuǎn)化及其調(diào)控機(jī)制的研究[D];杭州師范大學(xué);2016年

8 袁震;砷對(duì)巨噬細(xì)胞和肝細(xì)胞膽固醇流出及相關(guān)基因ABCA1和ABCG1表達(dá)的影響[D];杭州師范大學(xué);2016年

9 李曉琴;Fc99抑制單核/巨噬細(xì)胞表達(dá)Tenascin-C及緩解關(guān)節(jié)炎癥狀的研究[D];南京大學(xué);2014年

10 王凱凱;綠豆肽的結(jié)構(gòu)鑒定及對(duì)小鼠巨噬細(xì)胞免疫活性物質(zhì)的影響作用研究[D];黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué);2016年

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本文編號(hào)：874538