本文關鍵詞：HMGB1調控MDSCs分化參與乳腺癌發(fā)生的機制研究

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【摘要】：目的:1.通過對乳腺癌中HMGB1表達量、MDSCs比例的檢測,分析兩者在乳腺癌中的關系。2.通過檢測HMGB1、MDSCs之間的關系,研究HMGB1對MDSCs分化的影響及其潛在的分子機制。方法:1.分別從正常鼠、荷瘤鼠中分離出外周血、脾臟和腫瘤,流式細胞儀檢測外周血、脾臟中MDSCs的比例,q RT-PCR和Western blotting法測定荷瘤鼠腫瘤中HMGB1、i NOS及ARG1的表達水平。2.分離正常小鼠的骨髓、脾臟,分為對照組、HMGB1組、GM-CSF+IL-6組、GM-CSF+IL-6+HMGB1組和GM-CSF+IL-6+HMGB1+ethyl pyruvate(EP)組進行體外刺激48h后,流式細胞儀檢測MDSCs、DCs和巨噬細胞的比例。3.Western blot法檢測0min、15min、30 min、60 min、90 min和120 min六個時間點細胞中ERK1/2、STAT3、NF-κB和P38 MAPK蛋白磷酸化水平的改變,骨髓細胞用PDTC、Niclosamide、SB203580、U0126預處理1h后,再加入HMGB1重組蛋白刺激,流式細胞儀檢測MDSCs的比例。4.乳腺癌荷瘤鼠建模成功后,隨機分為兩組,一組給予EP治療,另一組給予PBS治療,3天一次,分別于25d和40d處死荷瘤鼠,流式細胞儀檢測脾臟、腫瘤中MDSCs的比例。5.從健康的BALB/c小鼠股骨中取出骨髓,用MDSCs免疫磁珠體外分選出G-MDSCs和M-MDSCs,體外用重組HMGB1刺激48h后,流式細胞儀檢測各組細胞中MDSCs、DCs和巨噬細胞的比例。結果:1.流式細胞儀檢測結果顯示荷瘤鼠外周血、脾臟中MDSCs的比例顯著高于正常鼠,q RT-PCR檢測發(fā)現(xiàn)腫瘤組織中HMGB1、i NOS和ARG1的表達量都顯著高于癌旁組織,差異有統(tǒng)計學意義。2.經過48h刺激后,流式細胞儀檢測結果發(fā)現(xiàn)HMGB1組、GM-CSF+IL-6組、GM-CSF+IL-6+HMGB1組相比于對照組,MDSCs比例增加,DCs和巨噬細胞的比例減少,差異有統(tǒng)計學意義;GM-CSF+IL-6+HMGB1+EP組相比于GM-CSF+IL-6+HMGB1組,MDSCs比例減少,DCs和巨噬細胞的比例增加。3.細胞給予250ng/m L HMGB1刺激后,0至120min內,細胞內p-ERK1/2、p-NF-κB、p-P38水平隨著時間推移逐漸增高,而p-STAT3卻沒有這種趨勢;給予U0126、SB203580和PDTC作用后,MDSCs比例下降且有統(tǒng)計學意義,而Niclosamide作用后MDSCs比例雖下調但并無統(tǒng)計學意義。4.荷瘤鼠給予EP治療后,EP組相比于PBS組,腫瘤的體積、重量、脾臟和腫瘤中MDSCs比例均減少且差異有統(tǒng)計學意義。5.MDSCs免疫磁珠體外分選出G-MDSCs和M-MDSCs,體外用HMGB1重組蛋白刺激48h后,流式細胞儀檢測發(fā)現(xiàn)HMGB1刺激組相對于G-MDSCs和M-MDSCs對照組,MDSCs比例均增加,DCs和巨噬細胞的比例均減少,但無統(tǒng)計學差異。結論:1.在乳腺癌中HMGB1表達上調,MDSCs比例增加,且兩者呈正相關關系。2.HMGB1通過NF-κB,ERK1/2和P38 MAPK信號通路調控MDSCs分化,且抑制HMGB1能減少MDSCs的募集,減緩腫瘤生長。
【關鍵詞】：高遷移率族蛋白B1 髓源性抑制細胞 乳腺癌 分化
【學位授予單位】：江蘇大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R737.9;R730.43
【目錄】：

• 摘要5-7
• Abstract7-12
• 縮略詞表12-15
• 第一章 緒論15-25
• 1.1 乳腺癌的研究現(xiàn)狀15-16
• 1.2 高遷移率族蛋白B116-19
• 1.2.1 高遷移率族蛋白B1的結構16
• 1.2.2 HMGB1的分泌和釋放16-17
• 1.2.3 HMGB1的受體及信號轉導通路17-18
• 1.2.4 HMGB1的生物學功能18-19
• 1.3 髓源性抑制細胞(Myeloid-derived suppressor cells, MDSCs)19-23
• 1.3.1 MDSCs的來源及亞群19-20
• 1.3.2 MDSCs的擴增及活化20-21
• 1.3.3 MDSCs的免疫抑制功能及MDSCs與腫瘤21-23
• 1.4 本研究的目的、方法、實驗設計和意義23-25
• 1.4.1 研究目的23
• 1.4.2 研究方法23
• 1.4.3 實驗設計23-24
• 1.4.4 實驗意義24-25
• 第二章 乳腺癌腫瘤微環(huán)境中MDSCs的變化及其與HMGB1的關系25-38
• 2.1 實驗儀器和試劑25-27
• 2.1.1 實驗儀器25-26
• 2.1.2 實驗試劑26-27
• 2.2 實驗方法27-32
• 2.2.1 流式細胞儀檢測外周血、脾臟中MDSCs比例27-28
• 2.2.2 實時熒光定量PCR檢測HMGB1、ARG1和iNOS表達28-30
• 2.2.3 溶液的配制30-31
• 2.2.4 免疫印跡法（Western blotting）31-32
• 2.2.5 統(tǒng)計學分析32
• 2.3 實驗結果32-36
• 2.3.1 乳腺癌荷瘤鼠模型的建立32-33
• 2.3.2 MDSCs在正常鼠、荷瘤鼠脾臟和外周血中的比例33-35
• 2.3.3 荷瘤鼠癌組織和癌旁組織中ARG1、iNOS和HMGB1的表達35-36
• 2.3.4 乳腺癌腫瘤微環(huán)境中HMGB1和MDSCs的相關性分析36
• 2.4 討論36-38
• 第三章 HMGB1調控MDSCs分化及其分子機制研究38-49
• 3.1 實驗儀器和試劑38-39
• 3.1.1 實驗儀器38-39
• 3.1.2 實驗試劑39
• 3.2 實驗方法39-42
• 3.2.1 MDSCs分離與純化39-41
• 3.2.2 流式細胞儀檢測MDSCs、DCs和巨噬細胞的比例41
• 3.2.3 免疫印跡法（Western blotting）41
• 3.2.4 統(tǒng)計學分析41-42
• 3.3 實驗結果42-46
• 3.3.1 HMGB1調控骨髓來源MDSCs的分化42-44
• 3.3.2 HMGB1通過ERK1/2、P38MAPK和NF-κB信號通路調控MDSCs的分化44-45
• 3.3.3 HMGB1調控M-MDSCs或G-MDSCs的分化45-46
• 3.4 討論46-49
• 第四章 抑制HMGB1延緩乳腺癌荷瘤鼠腫瘤的生長49-56
• 4.1 實驗儀器和試劑49-50
• 4.1.1 實驗儀器49
• 4.1.2 實驗試劑49-50
• 4.2 實驗方法50-51
• 4.2.1 乳腺癌荷瘤鼠的分組和治療50-51
• 4.2.2 流式細胞儀檢測各組荷瘤鼠脾臟和腫瘤組織中MDSCs的比例51
• 4.2.3 統(tǒng)計學分析51
• 4.3 實驗結果51-54
• 4.3.1 EP抑制HMGB1可以延緩腫瘤生長51-52
• 4.3.2 EP治療后腫瘤的生長曲線分析52-53
• 4.3.3 EP抑制HMGB1減少荷瘤鼠脾臟和腫瘤組織中MDSCs的比例53-54
• 4.4 討論54-56
• 第五章 乳腺癌腫瘤微環(huán)境中HMGB1表達上調及潛在機制研究56-64
• 5.1 實驗儀器、試劑和溶液的配制56-57
• 5.1.1 實驗儀器56-57
• 5.1.2 實驗試劑57
• 5.1.3 溶液的配制57
• 5.2 實驗方法57-59
• 5.2.1 皮下移植瘤模型的建立57
• 5.2.2 組織總RNA提取及定量PCR檢測miRNA、HMGB157-58
• 5.2.3 免疫印跡法（Western blotting）58-59
• 5.2.4 統(tǒng)計學分析59
• 5.3 實驗結果59-61
• 5.3.1 HMGB1在乳腺癌組織及癌旁組織的表達59-60
• 5.3.2 miR-21、miR-155、miR-218、miR-222、miR-494在乳腺癌組織及癌旁組織的表達水平60-61
• 5.3.3 miR-21、miR-155、miR-218、miR-222、miR-494和HMGB1表達的相關性分析61
• 5.4 討論61-64
• 主要結論與展望64-65
• 參考文獻65-76
• 致謝76-77
• 攻讀學位期間發(fā)表文章情況77

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