本文關(guān)鍵詞：PTBP1在結(jié)腸癌中的表達及生物學(xué)作用

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【摘要】：背景結(jié)腸癌為一種消化道腫瘤疾病,是除了肺癌和乳腺癌外的另一種高發(fā)性的腫瘤疾病。在各種腫瘤疾病中結(jié)腸癌的致死率居于第二位。結(jié)腸癌的發(fā)生有多種因素:如環(huán)境、飲食和遺傳等;也有生物體自身的因素,如原癌基因的激活或抑癌基因的抑制。由結(jié)腸癌的發(fā)病多因素可見其發(fā)病機制相當復(fù)雜,因此,了解原癌基因或抑癌基因在結(jié)腸癌發(fā)生和發(fā)展中的作用機制對結(jié)腸癌的治療有很大的幫助。PTBP1作為非單一核糖核蛋白家族中的一員,通過四個不同的結(jié)合區(qū)域與RNA相結(jié)合,改變RNA的結(jié)構(gòu)和調(diào)控RNA的可變剪切。PTBP1是一種可以在細胞核與細胞質(zhì)之間穿梭的蛋白,在一定條件下如細胞受到外界環(huán)境壓力:病毒感染,有毒物質(zhì)暴露時PTBP1蛋白由胞核穿梭出到細胞質(zhì)。在細胞核中PTBP1行使調(diào)控可變剪切的功能,與UTRS相結(jié)合增強基因的轉(zhuǎn)錄;在細胞質(zhì)中,PTBP1通過與3'UTR結(jié)合來增加m RNA的穩(wěn)定性,調(diào)控m RNA的定位和轉(zhuǎn)導(dǎo)。PTBP1以上的功能使其具有調(diào)控胰島β細胞中胰島素的分泌,細胞周期和凋亡相關(guān)蛋白表達,影響細胞的增殖,分裂和分化等重要生命活動。PTBP1與胚胎發(fā)育,神經(jīng)元分化,二型糖尿病和腫瘤的發(fā)生都有一定的關(guān)系。有研究表明,PTBP1在乳腺癌和卵巢癌中均高表達,且抑制PTBP1在二者中的表達可以明顯地降低細胞的增殖能力。但是與此結(jié)論相反的是,Lin等研究發(fā)現(xiàn),在非小細胞肺癌細胞H1299和A549中,過表達PTBP1可以降低細胞增殖的能力。以往的研究提示,PTBP1可能參與了人類腫瘤發(fā)生,但并不清楚是作為癌基因抑或是抑癌基因來發(fā)揮生物學(xué)作用的�；谀壳斑�沒有研究報道PTBP1在結(jié)腸癌當中的功能,并且結(jié)腸癌作為一種高發(fā)性的腫瘤疾病,有必要對其發(fā)病機制進行研究。因此,本論文旨在探究PTBP1在結(jié)腸癌發(fā)生和發(fā)展過程中的生物學(xué)功能,以期找出PTBP1在結(jié)腸癌發(fā)生中的分子作用機制,這將有利于臨床上對結(jié)腸癌的治療。第一章PTBP1在結(jié)腸癌組織芯片中的表達目的:通過組織芯片檢測PTBP1在人類正常結(jié)腸組織和癌組織中的表達,分析PTBP1在結(jié)腸癌旁組織和結(jié)腸癌組織中的表達變化。方法:1.收集90例結(jié)腸癌組織標本進行石蠟包埋2.將石蠟包埋組織切片并制作組織芯片3.應(yīng)用免疫組化技術(shù)檢測PTBP1在人類結(jié)腸組織和癌組織中的表達,并進行分析。結(jié)果:PTBP1在結(jié)腸癌組織中的表達高于其在結(jié)腸癌旁組織中的表達,且其表達與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和臨床分期相關(guān)。結(jié)論:PTBP1在結(jié)直腸癌發(fā)展過程中表達逐漸升高,提示其與結(jié)直腸癌的發(fā)展有關(guān),可以作為結(jié)腸癌分期的一個生物指標。第二章PTBP1基因?qū)Y(jié)腸癌細胞生物學(xué)行為的影響目的:檢測PTBP1在結(jié)腸正常和癌變細胞中的表達情況,抑制PTBP1在結(jié)腸癌細胞中的表達,觀察細胞的形態(tài),生長活力,細胞增殖,周期和凋亡等生物學(xué)行為的變化。方法:1.不同結(jié)腸細胞中PTBP1表達檢測:分別用Q-PCR和Western blot方法檢測FHC/HCT116/HCT8/SW480細胞中PTBP1 m RNA和蛋白水平的表達。2.檢測沉默PTBP1基因后HCT116和SW480細胞的生長活力:用PTBP1 si RNA轉(zhuǎn)染HCT116細胞。轉(zhuǎn)染48h后,用倒置顯微鏡(10×)觀察細胞形態(tài),每個樣品隨機選取5個視野觀察并拍照。用PTBP1 si RNA轉(zhuǎn)染HCT116和SW480細胞。于轉(zhuǎn)染后48h,分別用細胞增殖-毒性檢測試劑MTS和Ed U試劑檢測細胞活力和細胞增殖能力。3.檢測沉默PTBP1基因后HCT116和SW480細胞的周期:用PTBP1 si RNA轉(zhuǎn)染HCT116和SW480細胞,于轉(zhuǎn)染后48h,用細胞周期與凋亡檢測試劑盒按照說明書操作處理細胞,流式細胞儀檢測兩種細胞的周期變化。4.檢測沉默PTBP1基因后的HCT116和SW480細胞凋亡:用PTBP1 si RNA轉(zhuǎn)染HCT116和SW480細胞,于轉(zhuǎn)染后48h,用碧云天Hoechst33258試劑染色在熒光顯微鏡下觀測細胞形態(tài)的變化;用Annexing-FITC雙染試劑處理細胞后經(jīng)流式細胞儀檢測細胞凋亡變化。5.檢測沉默PTBP1基因后HCT116細胞對5-FU,順鉑和多柔比星的敏感性:用PTBP1 si RNA轉(zhuǎn)染HCT116細胞,于轉(zhuǎn)染后48h,分別加不同濃度的5-FU,順鉑和多柔比星處理細胞48h,最后用MTS檢測生長活性。結(jié)果:1.結(jié)腸癌細胞HCT116/SW480/HCT8中PTBP1 m RNA和蛋白的表達量均高于正常結(jié)腸細胞FHC,且在HCT116細胞中的表達量最高。2.用PTBP1 si RNA干擾HCT116和SW480細胞中PTBP1的表達后,HCT116和SW480細胞的活力降低,細胞增殖能力降低,細胞生長被抑制。3.用PTBP1 si RNA干擾HCT116和SW480細胞中PTBP1的表達后,與對照組相比,PTBP1 si RNA組的HCT116和SW480細胞周期被阻滯于S期。4.用PTBP1 si RNA干擾HCT116和SW480細胞中PTBP1的表達。與對照組相比,PTBP1 si RNA組的HCT116和SW480細胞發(fā)生明顯的細胞凋亡。5.用PTBP1 si RNA干擾HCT116的表達后,與對照組相比,PTBP1 si RNA組的HCT116細胞對5-FU,順鉑和多柔比星的敏感性增加。結(jié)論:PTBP1可調(diào)控腫瘤細胞的生長,抑制PTBP1表達,可降低腫瘤細胞的生長,其原因在于PTBP1低表達后,可導(dǎo)致細胞增殖能力降低、細胞周期阻滯、細胞凋亡增加,因此在結(jié)直腸癌的發(fā)生過程中,PTBP1是一個典型的癌基因。第三章PTBP1在結(jié)腸癌細胞中生物學(xué)功能的分子機制研究目的:探討PTBP1調(diào)控HCT116細胞增殖、周期和凋亡的分子機制。方法:1.PTBP1 si RNA干擾HCT116細胞中PTBP1的表達,用Western blot法檢測細胞增殖相關(guān)蛋白p-AKT、AKT和p85的變化。2.PTBP1 si RNA干擾HCT116細胞中PTBP1的表達,用Western blot法檢測細胞周期相關(guān)蛋白CDK4和cyclin D1的變化。3.PTBP1 si RNA干擾HCT116細胞中PTBP1的表達,用Western blot法檢測細胞凋亡相關(guān)蛋白p53、cyto C、Bcl-2、Bax、Caspase3和PARP1的變化。結(jié)果:1.與對照組相比,沉默PTBP1基因后,p-AKT和p85表達減少。2.與對照組相比,沉默PTBP1基因后,cyclin D1表達明顯下調(diào)。3.與對照組相比,沉默PTBP1基因后,p53和cyto C表達增加;抑制凋亡發(fā)生的Bcl-2的表達減少,促進凋亡發(fā)生的Bax表達增加;Caspase3和PARP1活化增加。結(jié)論:抑制PTBP1后可通過下調(diào)增殖相關(guān)蛋白p-AKT、p85,周期相關(guān)蛋白cyclin D1等表達抑制細胞生長;另一方面,增加凋亡相關(guān)蛋白cyto C、p53和Bax的表達,和下調(diào)Bcl-2的表達以及活化Caspase3和PARP1來誘導(dǎo)細胞凋亡。
【關(guān)鍵詞】：PTBP1 結(jié)腸癌 細胞周期 細胞凋亡
【學(xué)位授予單位】：河南大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R735.35
【目錄】：

• 摘要4-8
• ABSTRACT8-12
• 英文縮略詞12-17
• 前言17-23
• 第一章 PTBP1在結(jié)腸癌組織芯片中的表達23-29
• 1.1 實驗材料23-24
• 1.1.1 試劑23
• 1.1.2 組織標本23-24
• 1.2 實驗方法24-25
• 1.2.1 組織芯片制作24
• 1.2.2 Envision二部法免疫組化染色24-25
• 1.2.3 判斷染色結(jié)果25
• 1.2.4 統(tǒng)計方法25
• 1.3 結(jié)果25-27
• 1.3.1 標本臨床信息25
• 1.3.2 PTBP1在結(jié)腸癌組織和癌旁組織中的表達25-27
• 1.3.3 PTBP1與臨床分期27
• 1.4 討論27-29
• 第二章 PTBP1基因?qū)Y(jié)腸癌細胞生物學(xué)行為的影響29-49
• 2.1 材料29-31
• 2.1.1 試劑29-30
• 2.1.2 siRNA與抗體30
• 2.1.3 實驗儀器設(shè)備30-31
• 2.1.4 實驗耗材31
• 2.2 試驗方法31-38
• 2.2.1 細胞培養(yǎng)31-32
• 2.2.2 Real-time PCR法檢測PTBP1 m RNA的表達32-34
• 2.2.3 細胞轉(zhuǎn)染（均用6孔板接種細胞轉(zhuǎn)染）34
• 2.2.4 細胞活力檢測34-35
• 2.2.5 細胞周期檢測35
• 2.2.6 細胞凋亡檢測35-36
• 2.2.7 Hoechst染核檢測凋亡36
• 2.2.8 細胞形態(tài)學(xué)觀察36
• 2.2.9 EdU實驗36-37
• 2.2.10 生物信息處理軟件37-38
• 2.3 實驗結(jié)果38-46
• 2.3.1 PTBP1 m RNA在結(jié)腸正常細胞及腫瘤細胞中的表達38-39
• 2.3.2 PTBP1蛋白在結(jié)腸正常細胞及腫瘤細胞中的表達39-40
• 2.3.3 沉默PTBP1基因抑制結(jié)腸癌HCT116和SW480細胞生長40-41
• 2.3.4 沉默PTBP1基因可抑制HCT116細胞的增殖41-42
• 2.3.5 沉默PTBP1基因表達可誘導(dǎo)結(jié)腸癌HCT116和SW480細胞周期阻滯42-43
• 2.3.6 沉默PTBP1基因表達可誘導(dǎo)結(jié)腸癌HCT116和SW480細胞凋亡43-45
• 2.3.7 沉默PTBP1基因表達可增加結(jié)腸癌HCT116細胞對腫瘤藥物的敏感性45-46
• 2.4 討論46-49
• 第三章 PTBP1在結(jié)腸癌中生物學(xué)功能的機制研究49-59
• 3.1 材料49-50
• 3.1.1 試劑49-50
• 3.1.2 抗體、質(zhì)粒與si RNA50
• 3.1.3 實驗儀器設(shè)備50
• 3.1.4 實驗耗材50
• 3.2 試驗方法50-54
• 3.2.1 細胞培養(yǎng)50-51
• 3.2.2 細胞轉(zhuǎn)染（均用6孔板接種細胞轉(zhuǎn)染）51-52
• 3.2.3 免疫印跡（Western blot）52-53
• 3.2.4 生物信息處理軟件53-54
• 3.3 結(jié)果54-56
• 3.3.1 沉默PTBP1后結(jié)腸癌HCT116細胞增殖相關(guān)蛋白的改變54
• 3.3.2 沉默PTBP1后結(jié)腸癌HCT116細胞周期相關(guān)蛋白的改變54-55
• 3.3.3 沉默PTBP1后結(jié)腸癌HCT116細胞凋亡關(guān)蛋白的改變55-56
• 3.4 討論56-59
• 結(jié)論59-61
• 參考文獻61-65
• 在學(xué)期間的研究成果65-67
• 致謝67-68

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7 宋e，

本文編號：873591