本文關(guān)鍵詞：miRNA-373抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞U251遷移及侵襲作用的研究

  更多相關(guān)文章： 膠質(zhì)瘤 miRNA-373 CD44 TGFBR2 遷移 侵襲

【摘要】：膠質(zhì)母細(xì)胞瘤(glioblastomamultiforme,GBM)是成人最常見的中樞神經(jīng)系統(tǒng)惡性腫瘤,具有生長(zhǎng)迅速、侵襲能力強(qiáng)、惡性程度高以及易復(fù)發(fā)等潛能。盡管在手術(shù)切除聯(lián)合放射治療和以替莫唑胺為代表的化學(xué)治療等治療手段下,GBM病人的五年生存率仍不到5%。研究GBM侵襲進(jìn)展的分子機(jī)制,有助于設(shè)計(jì)更有效的治療手段,阻止疾病的進(jìn)展與復(fù)發(fā)。microRNAs(miRNAs)是一類長(zhǎng)度約為22個(gè)核苷酸的單鏈非編碼RNAs,主要通過(guò)轉(zhuǎn)錄后修飾途徑參與基因的表達(dá)調(diào)控。據(jù)估計(jì),哺乳動(dòng)物有超過(guò)50%的基因受到miRNAs調(diào)控。miRNAs幾乎參與細(xì)胞的所有進(jìn)程,包括細(xì)胞的增殖、死亡、凋亡、衰老、分化、遷移以及侵襲等。miRNAs的表達(dá)失調(diào)與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān),這些異常表達(dá)的miRNAs在腫瘤中發(fā)揮著癌基因或是抑癌基因的作用。鑒定出這些miRNAs并探究它們的功能和潛在靶點(diǎn),有助于發(fā)現(xiàn)新的具有診斷或預(yù)后功能的標(biāo)志物,并針對(duì)這些差異表達(dá)的miRNAs設(shè)計(jì)更有效的腫瘤治療靶點(diǎn)。miRNA-373(miR-373)在許多腫瘤中都存在著表達(dá)失調(diào),依據(jù)組織特異性的不同,miRNA-373在這些腫瘤中所發(fā)揮的作用也不同。有研究顯示,在睪丸癌、乳腺癌、食管癌和宮頸癌中,miR-373發(fā)揮著癌基因的作用;在肺癌、胰腺癌、卵巢癌和結(jié)腸癌中,miR-373發(fā)揮著抑癌基因的作用。在膠質(zhì)瘤中,miR-373的作用還未被充分的探究。本研究主要探討miR-373在GBM細(xì)胞系U251細(xì)胞中作用,包括對(duì)其增殖、遷移與侵襲的影響,并進(jìn)一步分析其發(fā)揮作用的功能靶點(diǎn)并對(duì)靶點(diǎn)進(jìn)行驗(yàn)證。目的:通過(guò)體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)探究miR-373對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞系U251增殖、遷移及侵襲的影響,并對(duì)相關(guān)機(jī)制做進(jìn)一步分析。方法:1.MTT法檢測(cè)miR-373對(duì)U251增殖的影響。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)miR-373對(duì)U251細(xì)胞凋亡的影響。2.細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)miR-373對(duì)U251細(xì)胞橫向遷移能力的影響。Transwell小室遷移及侵襲實(shí)驗(yàn)分析miR-373對(duì)U251縱向遷移能力及侵襲能力的影響。3.通過(guò)在線靶基因預(yù)測(cè)軟件和文獻(xiàn)檢索尋找miR-373發(fā)揮作用的功能靶點(diǎn)。雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)驗(yàn)證miR-373是否直接靶向靶基因mRNA的3’UTR端。4.RNA干擾和靶基因回復(fù)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證miR-373的功能靶點(diǎn)。結(jié)果:1.盡管過(guò)表達(dá)miR-373不影響U251的增殖、死亡與凋亡,但發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染miR-373模擬劑48小時(shí)后,與轉(zhuǎn)染miR-NC的對(duì)照組細(xì)胞相比,細(xì)胞變得圓鈍,觸角減少,說(shuō)明miR-373可能影響U251細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)能力。2.細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)和Transwell小室遷移與侵襲實(shí)驗(yàn)顯示,過(guò)表達(dá)miR-373明顯抑制U251的遷移和侵襲。3.通過(guò)靶基因預(yù)測(cè)軟件分析和文獻(xiàn)檢索,選取了2個(gè)可能與miR-373抑制遷移與侵襲相關(guān)的靶基因:CD44和TGFBR2,用qRT-PCR檢測(cè)CD44與TGFBR2mRNA表達(dá)量的變化,發(fā)現(xiàn)miR-373明顯下調(diào)CD44與TGFBR2mRNA表達(dá)。WesternBlot結(jié)果證實(shí)miR-373能明顯下調(diào)CD44與TGFBR2蛋白的表達(dá)。雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)證實(shí)miR-373直接作用于CD44和TGFBR2的3’UTR端。4.RNAi分別敲低CD44與TGFBR2后,U251細(xì)胞遷移與侵襲能力都受到抑制,這與過(guò)表達(dá)miR-373后對(duì)U251的影響一致。靶基因回復(fù)實(shí)驗(yàn)顯示,回復(fù)了U251細(xì)胞中CD44或TGFBR2的表達(dá)后,部分抵消了過(guò)表達(dá)miR-373后對(duì)細(xì)胞遷移與侵襲的抑制作用,這說(shuō)明miR-373抑制U251遷移與侵襲的機(jī)制與它下調(diào)CD44和TGFBR2有關(guān)。結(jié)論:1.miR-373盡管對(duì)U251的增殖無(wú)明顯作用,但能明顯減弱細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)能力,抑制細(xì)胞的遷移以及侵襲。2.CD44與TGFBR2是miR-373的兩個(gè)直接的功能靶點(diǎn)。3.miR-373通過(guò)下調(diào)CD44與TGFBR2的表達(dá)發(fā)揮抑制U251遷移與侵襲的用。4.miR-373能夠抑制由TGF-β所誘導(dǎo)的遷移與侵襲。
【關(guān)鍵詞】：膠質(zhì)瘤 miRNA-373 CD44 TGFBR2 遷移 侵襲
【學(xué)位授予單位】：濟(jì)南大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R739.41
【目錄】：

• 摘要6-8
• Abstract8-11
• 主要符號(hào)表11-13
• 前言13-17
• 材料與方法17-35
• 1.1 主要實(shí)驗(yàn)試劑及耗材17-20
• 1.2 主要儀器20-21
• 1.3 實(shí)驗(yàn)方法21-35
• 1.3.1 細(xì)胞培養(yǎng)21
• 1.3.2 細(xì)胞轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)21-23
• 1.3.3 MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖23
• 1.3.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡23-24
• 1.3.5 細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)與Transwell小室實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移與侵襲24-25
• 1.3.6 提取細(xì)胞總蛋白并行Western blot實(shí)驗(yàn)檢測(cè)蛋白表達(dá)量25-28
• 1.3.7 提取總RNAs和miRNAs28-30
• 1.3.8 q RT-PCR實(shí)驗(yàn)檢測(cè)m RNA以及miRNA表達(dá)水平30-33
• 1.3.9 雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)33
• 1.3.10 靶基因回復(fù)實(shí)驗(yàn)33-34
• 1.3.11 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法34-35
• 結(jié)果35-49
• 1.1 miR-373 不影響U251細(xì)胞生長(zhǎng)35-39
• 1.1.1 MTT細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)檢測(cè)miR-373 對(duì)U251增殖影響37-38
• 1.1.2 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)miR-373 對(duì)U251凋亡的影響38-39
• 1.2 miR-373 抑制U251遷移及侵襲39-42
• 1.2.1 細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)miR-373 對(duì)U251橫向遷移能力的影響40
• 1.2.2 Transwell遷移實(shí)驗(yàn)檢測(cè)miR-373 對(duì)U251縱向遷移能力影響40-41
• 1.2.3 Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)檢測(cè)miR-373 對(duì)U251侵襲能力影響41-42
• 1.3 miR-373 下調(diào)CD44與TGFBR2表達(dá)，，兩者均為miR-373 的靶基因42-48
• 1.3.1 miR-373 下調(diào)CD44與TGFBR2表達(dá)42-44
• 1.3.2 雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證CD44與TGFBR2是miR-373 的靶點(diǎn)44-46
• 1.3.3 miR-373 通過(guò)下調(diào)CD44與TGFBR2發(fā)揮抑制遷移和侵襲作用46-48
• 1.4 miR-373 能夠抑制由TGF-β 誘導(dǎo)的U251的遷移和侵襲48-49
• 討論49-54
• 結(jié)論54-55
• 參考文獻(xiàn)55-61
• 攻讀碩士學(xué)位期間發(fā)表的論文61-62
• 致謝62

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