本文關(guān)鍵詞：piRNA-823：一種新型非編碼小RNA在結(jié)直腸癌中的促腫瘤生成作用

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【摘要】：DNA甲基化是指在DNA甲基轉(zhuǎn)移酶(DNA methyltransferase,DNMT)的催化下,將S-腺苷甲硫氨酸(S-adenosylmethionine,SAM)的甲基轉(zhuǎn)移到特定堿基上的過程。DNMT分為兩類:一類是持續(xù)性甲基轉(zhuǎn)移酶DNMT 1,主要參與DNA復(fù)制過程中新合成鏈的甲基化;另一類是從頭甲基轉(zhuǎn)移酶,包括DNMT 3A和DNMT 3B,主要介導(dǎo)Cp G位點(diǎn)甲基化,通過表觀遺傳學(xué)機(jī)制調(diào)控細(xì)胞生長(zhǎng)分化。DNA甲基化參與了基因組印記、X染色體失活以及重復(fù)元件抑制過程,為正常發(fā)育所必需。近年來研究發(fā)現(xiàn),DNA甲基化異�？蓪�(dǎo)致原癌基因激活以及抑癌基因失活,從而導(dǎo)致癌癥的發(fā)生。結(jié)直腸癌是消化道常見的惡性腫瘤之一,其發(fā)生涉及基因突變及表觀遺傳學(xué)改變。其中表觀遺傳學(xué)改變更為常見,且影響著數(shù)百個(gè)腫瘤相關(guān)基因。DNA甲基化異常是最主要的表觀遺傳學(xué)改變,包括總體基因的低甲基化和特定區(qū)域的高甲基化,前者可導(dǎo)致原癌基因激活,后者主要發(fā)生在啟動(dòng)子區(qū)域的Cp G島,可導(dǎo)致抑癌基因失活,這兩種甲基化異常在散發(fā)性結(jié)腸癌發(fā)生中起著重要作用。Piwi蛋白相互作用RNAs(Piwi-interacting RNAs,pi RNAs)是近年來新發(fā)現(xiàn)的一類非編碼小RNAs。其僅僅與Argonaute蛋白家族的piwi亞家族蛋白結(jié)合,而不與Ago亞家族蛋白結(jié)合,因此被命名為pi RNAs。最初,pi RNAs被認(rèn)為僅存在于生殖干細(xì)胞中,通過DNA甲基化沉默轉(zhuǎn)座子來維持基因組的完整性,從而在生殖干細(xì)胞中發(fā)揮著表觀遺傳調(diào)控作用。最近,在多種癌細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)了pi RNAs的異常表達(dá),如胃癌、宮頸癌、乳腺癌和膀胱癌等等,且大量證據(jù)均表明,癌細(xì)胞與干細(xì)胞具有相似的表觀遺傳信號(hào),這暗示,pi RNAs可能在癌癥的發(fā)生中也發(fā)揮著相似的表觀遺傳調(diào)控作用。pi RNA-823為pi RNAs成員之一,在不同類型的腫瘤中其表達(dá)及作用不同。在胃癌中pi RNA-823表達(dá)降低,但在多發(fā)性骨髓瘤中其表達(dá)升高,并增加了從頭甲基化水平,然而,pi RNA-823在結(jié)直腸癌中的功能尚不明確。本課題旨在研究pi RNA-823在結(jié)直腸癌中的表達(dá)及其對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞系HCT 116增殖、凋亡及克隆形成能力的影響,并進(jìn)一步探討其在結(jié)直腸癌表觀遺傳調(diào)控中的功能,為開發(fā)以pi RNAs為靶點(diǎn)的結(jié)直腸癌治療提供理論依據(jù)。目的:研究pi RNA-823在結(jié)直腸癌中的表達(dá)及其對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞系HCT 116生物學(xué)行為的影響,并進(jìn)一步探討其對(duì)DNA甲基轉(zhuǎn)移酶表達(dá)的影響。方法:從河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院收集14對(duì)手術(shù)切除的新鮮結(jié)直腸癌及其癌旁組織標(biāo)本用于實(shí)驗(yàn)。應(yīng)用real time RT-PCR檢測(cè)pi RNA-823在結(jié)直腸癌及其癌旁組織中的表達(dá)差異,并進(jìn)一步應(yīng)用結(jié)腸癌細(xì)胞系HCT 116研究pi RNA-823在結(jié)直腸癌中的功能。在HCT 116細(xì)胞中轉(zhuǎn)染pi RNA-823的抑制劑pi RNA-823 antagomir,通過real time RT-PCR觀察轉(zhuǎn)染效率。應(yīng)用CCK-8實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞增殖情況,應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)觀察細(xì)胞周期變化,Annexin V/PI雙染及TUNEL技術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況,并進(jìn)一步應(yīng)用western blot檢測(cè)凋亡相關(guān)蛋白(caspase-8、caspase-9和caspase-3)的活性。最后,為了解pi RNA-823與DNA甲基化的關(guān)系,應(yīng)用western blot觀察其對(duì)DNMT 1、DNMT 3A、DNMT 3B表達(dá)的影響。結(jié)果:①Real time RT-PCR結(jié)果顯示,pi RNA-823在結(jié)直腸癌組織中的表達(dá)明顯高于其配對(duì)的癌旁組織(P0.05),并且以癌旁組織為對(duì)照,結(jié)腸癌細(xì)胞系HCT 116中pi RNA-823的表達(dá)也升高(P0.001)。②CCK-8實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,三種不同濃度的pi RNA-823的抑制劑pi RNA-823antagomir(10 nmol/L、30 nmol/L、100 nmol/L)能明顯抑制HCT 116增殖(P0.05),且呈現(xiàn)出劑量依賴性。③Real time RT-PCR結(jié)果顯示,在轉(zhuǎn)染后48 h,100 nmol/L的pi RNA-823 antagomir能有效下調(diào)pi RNA-823的表達(dá)(P0.05)。④流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示,抑制pi RNA-823表達(dá)后,G1期的細(xì)胞數(shù)明顯增多(P0.001),而S期和G2/M期的細(xì)胞數(shù)則相應(yīng)下降(P0.01),表明抑制pi RNA-823可以將HCT 116細(xì)胞阻滯在G1期,抑制G1/S期轉(zhuǎn)換。⑤Annexin V/PI雙染結(jié)果顯示,抑制pi RNA-823可導(dǎo)致凋亡細(xì)胞比例明顯升高(P0.001);TUNEL染色結(jié)果顯示,抑制pi RNA-823后,TUNEL染色陽性細(xì)胞率明顯升高(P0.001);Western blot結(jié)果顯示,抑制pi RNA-823可提高caspase-8、caspase-9及caspase-3的活性(P0.01)。以上結(jié)果表明,抑制pi RNA-823可促進(jìn)HCT 116細(xì)胞凋亡。⑥平板克隆形成實(shí)驗(yàn)和軟瓊脂克隆形成實(shí)驗(yàn)均顯示,抑制pi RNA-823表達(dá)后,HCT 116細(xì)胞克隆形成能力明顯降低(P0.01)。⑦Western blot結(jié)果顯示,抑制pi RNA-823可下調(diào)DNMT 3A和DNMT 3B的表達(dá)(P0.05),而對(duì)DNMT 1的表達(dá)沒有明顯影響(P=0.88),表明pi RNA-823可能通過調(diào)節(jié)從頭DNA甲基化水平參與結(jié)直腸癌發(fā)生。結(jié)論:pi RNA-823通過調(diào)節(jié)從頭DNA甲基轉(zhuǎn)移酶DNMT 3A和DNMT3B的表達(dá),促進(jìn)結(jié)腸癌細(xì)胞凋亡,抑制其增殖,從而參與結(jié)直腸癌的發(fā)生。pi RNA-823有望成為結(jié)直腸癌治療的新靶點(diǎn)。
【關(guān)鍵詞】：結(jié)直腸癌 piRNAs piRNA-823 DNA甲基化 表觀遺傳調(diào)控
【學(xué)位授予單位】：河北醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R735.34
【目錄】：

• 中文摘要4-7
• 英文摘要7-11
• 英文縮寫11-12
• 前言12-13
• 材料與方法13-27
• 結(jié)果27-30
• 附圖30-38
• 附表38-41
• 討論41-43
• 結(jié)論43
• 參考文獻(xiàn)43-47
• 綜述 piRNA-piwi通路在癌癥表觀遺傳學(xué)中的功能47-61
• 參考文獻(xiàn)55-61
• 致謝61-62
• 個(gè)人簡(jiǎn)歷62

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