本文關(guān)鍵詞：低劑量環(huán)磷酰胺對(duì)小鼠脾臟Treg細(xì)胞影響及聯(lián)合CIK細(xì)胞治療小鼠肝癌的研究

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【摘要】：目的通過研究單次和循環(huán)應(yīng)用環(huán)磷酰胺(cyclophosphamide,CTX)對(duì)荷瘤小鼠調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(regulatory T cells,Tregs)的影響及聯(lián)合細(xì)胞因子誘導(dǎo)的殺傷細(xì)胞(cytokine induced killer cells,CIKs)抗腫瘤的療效,初步探討環(huán)磷酰胺增強(qiáng)過繼性細(xì)胞免疫治療(adoptive cellular immunotherapy,ACI)腫瘤的機(jī)制,為提高ACI抗腫瘤療效提供思路。方法體內(nèi)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)以C57BL/6小鼠為研究對(duì)象,培養(yǎng)Hepa1-6小鼠肝癌細(xì)胞,注射于小鼠右側(cè)腋下建立小鼠肝癌皮下模型。觀察CTX對(duì)脾臟Tregs影響的實(shí)驗(yàn)中將造模成功的小鼠隨機(jī)分為4組,每組40只小鼠,分別為正常小鼠組,單純荷瘤小鼠組,單次應(yīng)用CTX組,循環(huán)應(yīng)用CTX組。每組分別用相應(yīng)治療方案干預(yù)后獲取小鼠脾臟單細(xì)胞懸液,流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)CD4+CD25+FoxP3+/CD4+T細(xì)胞比例,隔天測(cè)量小鼠腫瘤長短徑,計(jì)算腫瘤體積并繪制腫瘤生長曲線。體外培養(yǎng)CIKs實(shí)驗(yàn)將小鼠脾臟制成單細(xì)胞懸液,密度梯度離心法獲得脾臟單個(gè)核細(xì)胞做為培養(yǎng)CIKs的前體細(xì)胞,在體外經(jīng)干擾素-γ(interferon-γ,IFN-γ)、抗CD3e單克隆抗體(Anti CD3e monoclonal antibodies,anti-CD3Mab)、白介素-2(interlukin-2,IL-2)刺激,培養(yǎng)過程中繪制細(xì)胞增殖曲線,培養(yǎng)結(jié)束時(shí)用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)CIKs中的主要效應(yīng)細(xì)胞表型CD8+NK1.1+的含量,CCK-8法檢測(cè)CIKs對(duì)Hepa1-6肝癌細(xì)胞的殺傷活性。CTX聯(lián)合CIKs治療小鼠肝癌的實(shí)驗(yàn)中,將造模成功的荷瘤小鼠隨機(jī)分為6組,每組5只,分別為單純荷瘤組,單次CTX治療組,循環(huán)CTX治療組,單純CIKs治療組,單次CTX+CIKs治療組,循環(huán)CTX+CIKs治療組,每組分別用相應(yīng)治療方案干預(yù)后,隔天測(cè)量小鼠腫瘤長短徑,計(jì)算腫瘤體積并繪制腫瘤生長曲線,實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí),剝離瘤塊稱重,計(jì)算抑瘤率。結(jié)果在CTX對(duì)脾臟Tregs影響實(shí)驗(yàn),未經(jīng)CTX治療組的荷瘤小鼠脾臟Tregs比例隨時(shí)間延長逐漸增加;單次CTX治療組Tregs比例出現(xiàn)短暫的降低,隨后恢復(fù)到初始水平并持續(xù)升高;循環(huán)CTX組Tregs維持在較低水平。實(shí)驗(yàn)結(jié)束未經(jīng)治療的荷瘤小鼠、單次CTX、循環(huán)CTX治療組小鼠腫瘤體積分別為4056.5±865.4 mm3、3517.9±756.5 mm3、2256.4±620.3 mm3,單次CTX組與單獨(dú)荷瘤組腫瘤體積比較無差異(P0.05),循環(huán)CTX組體積明顯小于單獨(dú)荷瘤組(P0.01)。體外培養(yǎng)CIKs實(shí)驗(yàn)中,經(jīng)2周的培養(yǎng),細(xì)胞總量增加14.4倍;CD8+NK1.1+雙陽性細(xì)胞的比例有由最初的0.7±0.3%增加到17.7±2.3%;在對(duì)Hepa1-6細(xì)胞的殺傷活性,效靶比為10:1、20:1、40:1時(shí)殺傷活性分別為25.99±3.53%、38.26±3.65%、54.77±5.35%。在CTX聯(lián)合CIKs治療小鼠肝癌實(shí)驗(yàn),實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)單次CTX治療組腫瘤體積與荷瘤對(duì)照組腫瘤體積無明顯差異(3764.8±537.7 vs 3800.4±605.5 mm3,P=0.784);單獨(dú)CIKs小于荷瘤對(duì)照組(3352.2±485.4 vs 3800.4±605.5 mm3,P=0.02);循環(huán)CTX明顯小于單次CTX組(2076.6±620.2 vs 3764.8±537.7 mm3,P0.001);單次CTX+CIKs組明顯小于單次CTX組(1867.1±533.6 vs 3764.8±537.7 mm3,P0.001),還小于單獨(dú)CIKs組(1867.1±533.6 vs 3352.2±485.4 mm3,P0.001);循環(huán)CTX+CIKs組明顯小于循環(huán)CTX(970.7±135.3 vs 2076.6±620.2 mm3,P0.001)、單獨(dú)CIKs組(970.7±135.3 vs 3352.2±485.4 mm3,P0.001),還小于單獨(dú)CTX+CIKs組(970.7±135.3 vs 1867.1±533.6 mm3,P0.001)。后期單獨(dú)CTX或單獨(dú)CIKs治療組腫瘤體積迅速增加,而CTX和CIKs聯(lián)合治療組腫瘤體積保持平緩上升趨勢(shì)。實(shí)驗(yàn)結(jié)束單次CTX治療組,單獨(dú)CIKs治療組,循環(huán)CTX治療組,單次CTX+CIKs治療組,循環(huán)CTX+CIKs治療組5組抑瘤率分別為3.7%、5.2%、48.1%、54.4%、78.6%。結(jié)論隨著腫瘤發(fā)展,小鼠脾臟中Tregs比例逐漸增加;循環(huán)應(yīng)用CTX能夠使Tregs在較長時(shí)間內(nèi)維持在相對(duì)較低水平,一定程度上抑制腫瘤生長,因此在臨床應(yīng)用中更有價(jià)值;用小鼠細(xì)胞因子IFN-γ、IL-2和小鼠Anti-CD3Mab刺激小鼠脾臟單個(gè)核細(xì)胞可成功培養(yǎng)出C57BL/6小鼠的CIKs,為相關(guān)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的設(shè)計(jì)提供基礎(chǔ);低劑量CTX通過調(diào)控Tregs,能顯著提高CIKs的療效,以循環(huán)應(yīng)用CTX效果最好,為CTX調(diào)控Tregs的基礎(chǔ)上聯(lián)合過繼性免疫細(xì)胞治療的臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)。
【關(guān)鍵詞】：環(huán)磷酰胺 肝細(xì)胞癌 調(diào)節(jié)性T細(xì)胞 細(xì)胞因子誘導(dǎo)的殺傷細(xì)胞 免疫治療
【學(xué)位授予單位】：蘭州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R735.7
【目錄】：

• 中文摘要3-5
• Abstract5-10
• 引言10-11
• 第一章 背景回顧11-22
• 1 肝癌11-13
• 1.1 流行病學(xué)資料11
• 1.2 治療方案11-13
• 2 細(xì)胞因子誘導(dǎo)的殺傷細(xì)胞13-16
• 2.1 概述13-14
• 2.2 抗腫瘤機(jī)制14
• 2.3 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)及臨床應(yīng)用14-16
• 3 調(diào)節(jié)性T細(xì)胞16-19
• 3.1 概述16
• 3.2 抑制腫瘤免疫的機(jī)制16-17
• 3.3 控制調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的方案17-18
• 3.4 臨床相關(guān)性18-19
• 4 環(huán)磷酰胺19-22
• 4.1 概述19
• 4.2 對(duì)調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的調(diào)節(jié)19-20
• 4.3 對(duì)效應(yīng)T細(xì)胞的調(diào)節(jié)20-21
• 4.4 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)及臨床應(yīng)用21-22
• 第二章 實(shí)驗(yàn)研究22-43
• 研究一 環(huán)磷酰胺對(duì)小鼠脾臟調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的影響22-32
• 1 實(shí)驗(yàn)材料22-23
• 1.1 腫瘤細(xì)胞株和動(dòng)物22
• 1.2 主要試劑材料22
• 1.3 主要儀器22-23
• 1.4 溶液配制23
• 2 實(shí)驗(yàn)方法23-26
• 2.1 肝癌細(xì)胞培養(yǎng)23-24
• 2.2 肝癌荷瘤鼠模型的制備24-25
• 2.3 分組及干預(yù)25
• 2.4 小鼠脾臟淋巴細(xì)胞檢測(cè)25-26
• 2.5 觀察小鼠腫瘤體積變化26
• 2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法26
• 3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果26-29
• 3.1 Hepa1-6 肝癌細(xì)胞形態(tài)觀察26
• 3.2 小鼠脾臟CD4~+CD25~+Foxp3~+/CD4~+比值的動(dòng)態(tài)變化26-27
• 3.3 小鼠腫瘤體積觀察27
• 附圖27-29
• 4 討論29-32
• 研究二 環(huán)磷酰胺聯(lián)合CIK治療小鼠肝癌模型療效的研究32-43
• 1 實(shí)驗(yàn)材料32-34
• 1.1 腫瘤細(xì)胞和動(dòng)物32
• 1.2 試劑和藥物32
• 1.3 主要儀器32-33
• 1.4 溶液配制33-34
• 2 實(shí)驗(yàn)方法34-36
• 2.1 肝癌細(xì)胞培養(yǎng)34
• 2.2 建立小鼠肝癌模型34
• 2.3 小鼠脾臟CIK細(xì)胞的培養(yǎng)及功能檢測(cè)34-35
• 2.4 分組及干預(yù)35-36
• 2.5 觀察小鼠腫瘤體積變化36
• 2.6 剝出瘤塊稱重并計(jì)算抑瘤率36
• 2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法36
• 3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果36-40
• 3.1 肝癌Hepa1-6 細(xì)胞形態(tài)36
• 3.2 細(xì)胞因子誘導(dǎo)的殺傷細(xì)胞增殖動(dòng)態(tài)觀察36-37
• 3.3 培養(yǎng)前及培養(yǎng)后的細(xì)胞因子誘導(dǎo)的殺傷細(xì)胞殺傷活性比較37
• 3.4 觀察各治療組腫瘤體積變化37
• 3.5 腫瘤質(zhì)量及抑瘤率觀察37-38
• 附圖38-40
• 4 討論40-43
• 第三章 結(jié)論43-44
• 參考文獻(xiàn)44-53
• 在學(xué)期間的研究成果53-54
• 致謝54-55
• 中英文縮略詞表55-57

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