miR-155-5p在食管鱗癌中的表達(dá)及功能
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【摘要】:研究背景食管癌是人類最常見(jiàn)的癌癥之一,為全球第六位,死亡率很高。據(jù)WHO的最新統(tǒng)計(jì)80%食管癌發(fā)生在發(fā)展中國(guó)家,中國(guó)是食管癌發(fā)生病例最多的國(guó)家,也是世界上食管癌高死亡率的國(guó)家之一。中國(guó)每年死于食管癌的患者約有15萬(wàn)。食管癌組織學(xué)分型主要有2個(gè):食管鱗狀細(xì)胞癌(鱗癌)和食管腺癌。食管腺癌常見(jiàn)于歐美國(guó)家,而我國(guó)食管癌的發(fā)病以食管鱗癌為主,約占90%。食管癌有高度轉(zhuǎn)移和襲性特點(diǎn),其早期發(fā)現(xiàn)較為不易,被確診時(shí)多為中晚期,所以食管癌術(shù)后死亡率高,5年存活率只有15%-25%。解決食管癌中晚期生存率低的一個(gè)重要途徑就是能夠早期發(fā)現(xiàn),早期診斷,早期治療。目前臨床上食管癌的主要診斷方法分為以下5種:1.纖維內(nèi)窺鏡檢查。2.食管內(nèi)鏡超聲檢查。3.食管脫落細(xì)胞學(xué)檢查。4.X射線鋇餐造影。5.胸部CT掃描。這些方法均不能有效地早期發(fā)現(xiàn)食管癌的發(fā)生。早期診斷是患者存活的關(guān)鍵,食管癌標(biāo)記性miRNA基因或信號(hào)的檢測(cè),對(duì)于假陽(yáng)性及不必要的檢查與治療都有重要的意義。因而,若能進(jìn)一步闡明食管癌發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制,提高食管癌的早期診斷,則有望提高食管癌的治愈率,降低死亡率。微小RNA (miRNA)調(diào)控是當(dāng)前生命科學(xué)的重要前沿。在高等生物中,miRNA在細(xì)胞代謝、分化、信號(hào)傳導(dǎo)、凋亡以及免疫應(yīng)答等幾乎全部的重要生命活動(dòng)中起到關(guān)鍵性作用。而且已有研究表明,miRNA在癌癥的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移、侵襲及血管生成等各方面起著非常重要的調(diào)控作用。因此將兩方面的研究結(jié)合在一起,研究與食管癌的發(fā)生有關(guān)的miRNA及其功能,將有助于對(duì)食管癌發(fā)生機(jī)制的理解,也會(huì)促進(jìn)食管癌診斷技術(shù)的發(fā)展,從而加速這一技術(shù)在臨床診斷和生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用。MicroRNA (miRNA)是一類含有18-25個(gè)核苷酸的非編碼的小分子RNA。它通過(guò)與其靶mRNA分子非編碼區(qū)3’-UTR或其它部位互補(bǔ)結(jié)合,特異性抑制或增強(qiáng)基因表達(dá),從而參與調(diào)控細(xì)胞的生長(zhǎng)、發(fā)育和分化等許多復(fù)雜的生命過(guò)程。miRNAs在生物學(xué)和病理過(guò)程包括細(xì)胞分化和增殖中起重要作用,影響細(xì)胞凋亡和代謝。miRNA可以作為促癌基因或抑癌基因。有研究發(fā)現(xiàn)越來(lái)越多的miRNA與腫瘤發(fā)生、發(fā)展、增殖、凋亡及轉(zhuǎn)移有密切關(guān)聯(lián),至少不下于數(shù)百中,其中很多miRNA被發(fā)現(xiàn)和食管癌的發(fā)生發(fā)展有關(guān),但是這些miRNA與基因表達(dá)的調(diào)控方式及調(diào)節(jié)機(jī)制尚且不太清楚。miR-155是一個(gè)典型的多功能的miRNA。越來(lái)越多的實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明miR-155在細(xì)胞代謝、分化、信號(hào)傳導(dǎo)、凋亡以及免疫應(yīng)答等多種生物學(xué)過(guò)程中起到重要性作用。miR-155是位于人類的21號(hào)染色體的非編碼RNA,它的表達(dá)水平受BIC轉(zhuǎn)錄水平及miRNA加工等的調(diào)控。其中不含開(kāi)放讀碼框的BIC,表達(dá)上調(diào)能夠促進(jìn)細(xì)胞的異常增殖。還有研究表明,miR-155結(jié)合MX 11等基因,通過(guò)增強(qiáng)myc的基因活性,從而可以促進(jìn)細(xì)胞的增殖。有研究發(fā)現(xiàn)miR-155和BIC的表達(dá)水平在血液腫瘤的發(fā)生發(fā)展中為上調(diào)狀態(tài),如彌漫大B淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤。大量實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明了miR-155在眾多的腫瘤疾病中表達(dá)水平上調(diào),而且其在腫瘤發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中起到了重要性的作用,并且它的作用主要是起到促癌的作用。據(jù)報(bào)道,miR-155-5p在乳腺癌、大腸癌、肺癌、子宮內(nèi)膜癌、胰腺癌、宮頸癌等惡性腫瘤組織中表達(dá)上調(diào),并與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后的關(guān)系密切相連。近期劉輝等發(fā)現(xiàn)miR-155-5p在食管鱗癌組織中高表達(dá),但尚不明確其在食管鱗癌發(fā)生發(fā)展中的作用及具體分子機(jī)制。本研究采用qPCR檢測(cè)miR-155-5p在食管鱗癌組織中的表達(dá)情況,并利用miR-155-5p類似物和抑制劑上調(diào)和下調(diào)食管鱗癌細(xì)胞Ecal09中miR-155-5p的表達(dá),研究其在食管鱗細(xì)胞增殖、凋亡和遷移中的作用。研究方法1、標(biāo)本收集收集2014年12月到2015年6月在上海奉賢區(qū)中心醫(yī)院和上海仁濟(jì)醫(yī)院胸外科手術(shù)切除的20例食管鱗癌組織及其鄰近食管正常組織距病變部位5 cm以上標(biāo)本;颊吣挲g為43-74歲,平均年齡為58歲。所有患者術(shù)前均未進(jìn)行任何化療、放療,且術(shù)前檢查均未發(fā)現(xiàn)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移;颊咝惺彻馨└涡g(shù)后,從手術(shù)切除的食管癌組織中留取腫瘤標(biāo)本(避免取腫瘤壞死區(qū)),同時(shí)在距腫瘤邊緣5 cm處留取正常食管組織作為癌旁組織,所有標(biāo)本均在液氮罐中凍存。20例食管鱗癌標(biāo)本最終病理診斷均為食管鱗癌(ESCC)。2、細(xì)胞培養(yǎng)人食管鱗癌Eca109細(xì)胞購(gòu)自中科院細(xì)胞庫(kù),用含10%小牛血清及1%雙抗的RPMI1640培養(yǎng)基,在37℃,5%C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細(xì)胞融合度達(dá)到70-80%,用0.25%胰酶37℃消化10分鐘,進(jìn)行細(xì)胞傳代或分組實(shí)驗(yàn)。3、實(shí)時(shí)熒光定量qPCR檢測(cè)組織miR-155-5p的表達(dá)水平提取細(xì)胞總RNA,檢測(cè)RNA質(zhì)量和濃度。采用特異性U6內(nèi)參反轉(zhuǎn)錄引物及miR-155-5p反轉(zhuǎn)錄引物及參照miRNA cDNA Synthesis kit試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。采用qPCR檢測(cè)miR-155-5p的表達(dá)情況。4、細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-155-5p類似物mimic、抑制劑inhibitor及陰性對(duì)照(mimic-NC、 inhibitor-NC)由廣州銳博生物科技有限公司設(shè)計(jì)合成,轉(zhuǎn)染試劑LipofectamineTM 2000購(gòu)自于美國(guó)Invitrogen公司。我們將人食管鱗癌Eca109細(xì)胞分為五組,分別如下:miR-55-5p mimic類似物(Lipofectamine2000+miR-55-5p mimic); NC(mimic)陰性對(duì)照組(Lipofectamine2000+NC(mimic)); miR-55-5p inhibitor抑制物組(Lipofectamine2000+miR-55-5p inhibitor); NC(inhibitor)陰性對(duì)照組(Lipofectamine2000+NC(inhibitor));未轉(zhuǎn)染空白對(duì)照組Blank組(僅加同等量Lipofectamine2000旨質(zhì)體)。轉(zhuǎn)染前在6孔板中種植人食管鱗癌Eca109細(xì)胞,待細(xì)胞達(dá)到70-80%融合時(shí)按轉(zhuǎn)染說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。5、實(shí)時(shí)熒光定量qPCR法檢測(cè)轉(zhuǎn)染后EC109細(xì)胞中miR-155-5p的表達(dá)水平收集4中轉(zhuǎn)染24 h后的各組細(xì)胞,按qPCR試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行檢測(cè)和分析各組細(xì)胞中miR-155-5p的表達(dá)水平。6、細(xì)胞增殖買驗(yàn)(CCK8)我們將人食管鱗癌Eca109細(xì)胞分為五組。收集轉(zhuǎn)染6 h后的各組細(xì)胞,接種于96孔板中,分別繼續(xù)培養(yǎng)1,2,3d后,實(shí)驗(yàn)參照CCK8試劑盒說(shuō)明書(shū),在酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀上讀取450 nm波長(zhǎng)處各孔的吸光度(OD)值。7、細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)(AnnexinV-PI雙染法)我們將人食管鱗癌Eca109細(xì)胞分為五組。收集轉(zhuǎn)染24 h后的食管鱗癌Eca109細(xì)胞,以1000r/min離心5 min收集(1—5)x 105個(gè)細(xì)胞,實(shí)驗(yàn)參照AnnexinV-PI試劑盒說(shuō)明書(shū),1 h內(nèi)流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。8、細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)我們將人食管鱗癌Eca109細(xì)胞分為五組。將Eca109細(xì)胞接種至6孔板中,轉(zhuǎn)染24 h后用槍頭在6孔板中劃痕,用無(wú)血清培養(yǎng)基洗滌去掉脫落細(xì)胞,加入無(wú)血清RPMI-1640培養(yǎng)基,于37℃、5%CO2繼續(xù)培養(yǎng)。分別在劃痕后0,24 h拍照,觀察劃痕愈合能力。9、統(tǒng)計(jì)學(xué)方法定量qPCR驗(yàn)證檢測(cè)出有表達(dá)差異的miRNA,以達(dá)到閾值Ct值的最低循環(huán)數(shù)計(jì)算樣本中miRNA的RNA拷貝數(shù)相對(duì)量。其相對(duì)表達(dá)量計(jì)算公式是2一△Ct和2-△△Ct表示,其中∧Ct=Ct目的-Ct內(nèi)參U6,△△Ct=Ct癌組織—Ct癌旁組織。2—△△Ct代表癌組織與配對(duì)癌旁組織中的目的基因RNA拷貝數(shù)的比值。呈正態(tài)分布的配對(duì)資料用配對(duì)t-檢驗(yàn),呈非正態(tài)分布的配對(duì)資料用秩和檢驗(yàn),多組間的均數(shù)比較用單因素方差分析。用SPSS17.0軟件來(lái)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,p0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果1、食管鱗癌組織中miR-155-5p的表達(dá)水平高于癌旁組織。利用qPCR法對(duì)20例食管鱗癌組織及其相應(yīng)癌旁組織中miR-155-5p的表達(dá)水平進(jìn)行檢測(cè)。以癌旁組織中miR-155-5p的表達(dá)水平為100%,則食管鱗癌組織中miR-155-5p的表達(dá)水平(529.42%)明顯高于其相應(yīng)的癌旁組織(P0.01)。2、Eca-109細(xì)胞中miR-155-5p的轉(zhuǎn)染效率檢測(cè)。我們將人食管鱗癌Eca109細(xì)胞分為五組。Eca109細(xì)胞轉(zhuǎn)染50 nmol/L miRNA-155-5p類似物及150 nmol/L抑制劑24 h后,利用qPCR對(duì)細(xì)胞內(nèi)miR-155-5p的表達(dá)水平進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果顯示,類似物轉(zhuǎn)染組的miR-155-5p表達(dá)量較對(duì)照組顯著提高(P0.01),而抑制物組的miR-155-5p表達(dá)量較對(duì)照組顯著降低(P0.01)。提示該法可提高Eca-109細(xì)胞內(nèi)miR-155-5p的表達(dá)量,可用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。3、miR-155-5p對(duì)食管鱗癌細(xì)胞增殖的影響。我們將人食管鱗癌Ecal 09細(xì)胞分為五組。將miR-155-5p類似物和抑制劑轉(zhuǎn)染Eca109細(xì)胞24 h、48 h、72 h后,利用CCK8法對(duì)各組細(xì)胞的細(xì)胞活力進(jìn)行檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),在轉(zhuǎn)染后24 h、48 h、72 h類似物組及抑制劑組的細(xì)胞活力與對(duì)照組(100%)相比,均未見(jiàn)顯著性差異(P0.05)。提示,miR-155-5p類似物及抑制劑轉(zhuǎn)染對(duì)Eca109細(xì)胞的增殖無(wú)明顯影響。4、miR-155-5p對(duì)食管鱗癌細(xì)胞凋亡的影響。我們將人食管鱗癌Eca109細(xì)胞分為五組。收集轉(zhuǎn)染后各組細(xì)胞進(jìn)行AnnexinV/PI雙染,利用流式細(xì)胞術(shù)(FCM)檢測(cè)細(xì)胞凋亡,以評(píng)價(jià)miR-155-5p對(duì)食管鱗癌細(xì)胞凋亡的影響。結(jié)果顯示,類似物轉(zhuǎn)染組的細(xì)胞凋亡率為5.43%±3.09%,較對(duì)照組(5.67%±1.99%)無(wú)明顯變化(P0.05)。同時(shí),抑制劑組的細(xì)胞凋亡率為5.26%±1.98%,較對(duì)照組亦無(wú)明顯變化(P0.05)。表明轉(zhuǎn)染24 h后,miR-155-5p對(duì)Eca109細(xì)胞的凋亡無(wú)明顯影響。5、miR-155-5p對(duì)食管鱗癌細(xì)胞遷移能力的影響。我們將人食管鱗癌Eca109細(xì)胞分為五組。劃痕實(shí)驗(yàn)的結(jié)果表明,轉(zhuǎn)染miR-155-5p類似物24 h后,Eca109細(xì)胞的遷移能力較空白對(duì)照組顯著提高(P0.05);而抑制劑組的細(xì)胞遷移能力無(wú)明顯影響(P0.05)。這提示上調(diào)miR-155-5p的表達(dá)可促進(jìn)Eca109細(xì)胞的遷移。結(jié)論1、食管鱗癌組織中miR-155-5p的表達(dá)明顯上調(diào),可能與食管鱗癌的發(fā)生發(fā)展有關(guān)。2、上調(diào)miR-155-5p的表達(dá)對(duì)Eca109增殖和凋亡未見(jiàn)明顯影響,顯著促進(jìn)了Eca-109細(xì)胞的遷移。3、下調(diào)miR-155-5p的表達(dá)對(duì)Eca109增殖凋亡和遷移未見(jiàn)明顯影響4、miR-155-5p的表達(dá)變化可能與食管鱗癌轉(zhuǎn)移有關(guān)。
【關(guān)鍵詞】:食管鱗癌 miR-155-5p Eca109 增殖 凋亡 遷移
【學(xué)位授予單位】:南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】:碩士
【學(xué)位授予年份】:2016
【分類號(hào)】:R735.1
【目錄】:
- 摘要3-9
- ABSTRACT9-17
- 前言17-27
- 第一章 食管鱗癌組織中miR-155-5p的表達(dá)及臨床意義27-36
- 一、材料和方法28-33
- 1、實(shí)驗(yàn)材料28-29
- 2、實(shí)驗(yàn)方法29-33
- 二、結(jié)果33-34
- 三、討論34-36
- 第二章 體外miR-155-5p表達(dá)對(duì)食管鱗癌Eca109細(xì)胞增殖、凋亡、遷移的影響36-54
- 一、材料和方法37-47
- 1、實(shí)驗(yàn)材料37-38
- 2、實(shí)驗(yàn)方法38-47
- 二、結(jié)果47-51
- 三、討論51-54
- 參考文獻(xiàn)54-60
- 全文總結(jié)60-61
- 英文縮寫(xiě)詞一覽表61-62
- 攻讀學(xué)位期間成果62-63
- 致謝63-65
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3 孟慧;miR-330-3p和miR-26b在食管鱗癌中的功能及其調(diào)控機(jī)制探討[D];第三軍醫(yī)大學(xué);2015年
4 周韶梅;miR-100在食管鱗癌中的調(diào)控作用及機(jī)制研究[D];北京工業(yè)大學(xué);2015年
5 曾薇;食管鱗癌中Survivin對(duì)NF-κB p65調(diào)控機(jī)制的研究[D];新疆醫(yī)科大學(xué);2015年
6 楊宏麗;PRKDC、XRCC4多態(tài)性與中國(guó)安陽(yáng)地區(qū)食管鱗癌發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)關(guān)聯(lián)性研究[D];山東大學(xué);2015年
7 崔瑤;STAT3對(duì)缺氧誘導(dǎo)食管鱗癌上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的調(diào)控作用[D];鄭州大學(xué);2016年
8 楊璇;miR-1207-5p對(duì)食管鱗癌發(fā)生的影響[D];鄭州大學(xué);2016年
9 江亞南;T-LAK細(xì)胞來(lái)源的蛋白激酶(TOPK)在食管鱗癌增殖中的功能研究[D];鄭州大學(xué);2016年
10 寧忠華;系統(tǒng)性炎癥和臨床病理因素對(duì)食管鱗癌的預(yù)后影響[D];蘇州大學(xué);2016年
中國(guó)碩士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前10條
1 劉建平;MTA1、VEGF-C在食管鱗癌中的表達(dá)及與臨床病理、腫瘤淋巴管生成的關(guān)系[D];川北醫(yī)學(xué)院;2015年
2 范玉宏;Caveolin-1在食管鱗癌浸潤(rùn)進(jìn)展中的作用研究[D];河北醫(yī)科大學(xué);2015年
3 聞朋浩;同期放化療聯(lián)合DC-CIK對(duì)Ⅰ~Ⅱ期食管鱗癌的療效分析[D];新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院;2015年
4 王春麗;食管鱗癌高頻擴(kuò)增基因IGHMBP2的鑒定及其功能的初步研究[D];安徽醫(yī)科大學(xué);2015年
5 劉嬌;GPRC5A和STAT3在食管鱗癌中的表達(dá)及意義[D];鄭州大學(xué);2015年
6 朱毓卉;江蘇省泰興地區(qū)食管癌時(shí)空分布特征分析及女性生殖因素研究[D];山東大學(xué);2015年
7 孫智;黏蛋白1在食管鱗癌中的表達(dá)及其與臨床病理及預(yù)后的關(guān)系[D];山東大學(xué);2015年
8 楊蕾;熱休克蛋白HSP32、HSP27在食管鱗癌轉(zhuǎn)移中作用的研究[D];第四軍醫(yī)大學(xué);2015年
9 楚旭;CDC2及PFTK1在食管鱗癌中的表達(dá)及其臨床意義[D];河南科技大學(xué);2015年
10 范俊利;EZH2、BMI-1、FBXW7在食管鱗癌中表達(dá)的臨床意義[D];河南科技大學(xué);2015年
,本文編號(hào):864483
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