本文關鍵詞：鞘氨醇磷酸膽堿促進心肌及非小細胞肺癌細胞自噬的分子機制研究

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【摘要】：研究背景及目的鞘氨醇磷酸膽堿(SPC)是存在于血液中的一種天然生物活性鞘磷脂,與其它生物活性脂類如溶血性磷脂酸(LPA),1-磷酸鞘氨醇(S1P)類似,SPC除了作為生物膜上的結構組分以外,還可以作為信號分子調節(jié)細胞分化,增殖和凋亡等過程。另外,SPC參與了多種疾病的發(fā)生發(fā)展過程,包括癌癥,心血管疾病,尼曼-匹克疾病,過敏性皮膚炎,腦血管痙攣等。因此,作為一種能夠調節(jié)疾病的生物活性鞘磷脂類衍生物,SPC具有廣闊的研究前景。心肌梗塞(Myocardial Infarction, MI)是引發(fā)發(fā)展中國家中老年人死亡的重要原因之一。心臟血液供應中斷導致心肌無法得到充足的氧氣和養(yǎng)料,引發(fā)心肌細胞凋亡是缺血性心肌損傷的主要機制。心肌細胞是終末分化的細胞,其分裂增殖能力極低,因此缺血導致的心肌細胞損失往往對心臟造成不可逆的損傷。自噬是細胞中存在的一種非常保守的過程,能夠清除細胞內的長壽命蛋白和損傷的細胞器,維持細胞內環(huán)境的穩(wěn)態(tài)。細胞內外的各種刺激都能夠引起細胞的自噬,而越來越多的研究也表明自噬在細胞命運的決定中發(fā)揮著重要的作用。適度自噬可以抑制細胞凋亡,促進存活；過度的自噬則可以引起細胞的死亡,被稱為自噬性死亡。而關于細胞自噬和細胞死亡之間的關系及調節(jié)機制仍然需要進一步的研究。針對以上科學問題,本論文研究了SPC在心肌細胞中的作用,探究了SPC誘導的自噬與心肌細胞凋亡的關系,并且進一步研究了SPC調節(jié)自噬的分子機制。我們的研究為闡明細胞凋亡和自噬的關系,了解生物活性脂類SPC對自噬信號的調節(jié)機制提供了新的實驗證據(jù),為診斷和治療缺血性心臟疾病提供了新的生物指標和潛在的作用靶點。我們的前期研究發(fā)現(xiàn)SPC能夠廣泛促進血管內皮細胞和心肌細胞的自噬,我們推測SPC在誘導細胞自噬方面具有廣譜性。許多研究表明自噬在癌癥的發(fā)生發(fā)展和治療過程中具有復雜的影響。作為一種細胞防御機制,自噬能夠通過促進代謝前體的循環(huán)利用,抑制炎癥等過程促進腫瘤細胞的存活,引起化療過程中腫瘤細胞的抗藥性。另一方面,許多藥物能夠通過引起細胞的自噬性死亡來達到殺死癌細胞的目的。然而,目前關于自噬在肺癌及其治療中的作用的研究較少。因此我們就SPC對非小細胞肺癌細胞自噬及存活的作用進行了深入研究。我們的研究不僅驗證了SPC對自噬誘導的普遍性,同時也為非小細胞肺癌的診斷和治療的提供了生物檢測指標和治療靶點。研究結果1.SPC通過脂筏PTEN/Akt1/mTOR介導的自噬抑制心肌細胞凋亡1.1 SPC抑制心肌細胞凋亡我們利用缺氧誘導原代大鼠乳鼠心肌細胞(NRCM)凋亡,利用去血清誘導H9c2心肌細胞凋亡,并且檢測了SPC對該過程的影響。Hoechst 33258染色顯示SPC抑制NRCM和H9c2細胞核凝集和片段化。ANXA5-PE/PI細胞染色及流式細胞檢測顯示,SPC能夠抑制缺氧誘導的NRCM凋亡；western blot結果顯示,SPC抑制H9c2細胞中凋亡蛋白Caspase 3和PARP1的切割。另外,SPC逆轉了去血清引起的H9c2細胞內ROS水平的升高。因此,SPC可以抑制心肌細胞的凋亡。1.2 SPC誘導心肌細胞自噬自噬能夠調節(jié)凋亡,為了了解SPC對心肌細胞自噬的影響,我們檢測了SPC對H9c2細胞自噬指標的影響。Western blot結果顯示SPC能夠促進LC3 Ⅱ的積累。為了檢測自噬小體的形成,我們轉染GFP-LC3表達質粒進入H9c2細胞,熒光顯微共聚焦檢測發(fā)現(xiàn),SPC處理組心肌細胞中GFP-LC3點狀聚集顯著增多。為了進一步明確SPC對自噬流的影響,我們檢測了自噬的底物,P62。SPC促進p62的降解。Bafilomycin A1預處理H9c2細胞阻止自噬流進一步促進了SPC誘導的LC3 Ⅱ的積累,抑制了SPC引起的p62的降解。這些結果顯示SPC能夠促進H9c2細胞的自噬流。1.3 SPC通過誘導自噬抑制心肌細胞凋亡為了明確SPC誘導的自噬在心肌細胞凋亡中的作用,我們用自噬的抑制劑3MA抑制了SPC誘導的自噬,檢測凋亡情況。Western blot結果顯示,抑制自噬后逆轉了SPC對凋亡蛋白Caspase 3和Caspase 7切割的抑制作用。說明SPC通過誘導自噬抑制心肌細胞凋亡。1.4 SPC通過mTOR和JNK信號通路誘導自噬MTOR復合物mTORCl是自噬活性的主要控制中心。因此我們檢測了mTORCl的活性。Western blot結果顯示,SPC在5 min能夠迅速促進mTORCl底物p70S6K和4EBP1磷酸化,但是在隨后的12 h下調p70S6K和4EBP1磷酸化。因此,SPC能夠調節(jié)mTORCl的活性。自噬主要由mTOR和Beclinl/Vps34兩個復合物來調節(jié),我們進一步檢測SPC對Beclinl/Vps34的影響。Western blot結果顯示,SPC并不影響B(tài)eclinl的水平,說明SPC誘導的自噬是beclin1非依賴的。JNK和p38MAPK,屬于MAPK信號通路,在凋亡和自噬調節(jié)中具有重要作用。有研究表明SPC能夠調節(jié)JNK和P38MAPK活性,因此我們檢測了SPC對心肌細胞中這兩種蛋白的活性影響。Western blot結果顯示,SPC顯著增強JNK的磷酸化但是并不影響p38MAPK活性。JNK的抑制劑SP600125預處理細胞能夠逆轉SPC對自噬的誘導作用。1.5 SPC是Akt的分子開關PI3K/Akt是mTOR和JNK的上游調節(jié)因子,并且是細胞存活及自噬的重要調控因子。因此,我們深入研究了SPC對Akt活性的影響。與mTORCl活性相對應,SPC也可以在早期5 mmin時激活Akt,而在隨后的6h和12h抑制Akt的磷酸化。PI3K/Akt抑制劑LY294002和Wortmannin預處理1h進一步促了SPC誘導的自噬,說明對Akt/mTOR信號活性的抑制介導了SPC誘導的自噬。Akt具有三個亞型：Akt 1,Akt 2和Akt 3,我們利用免疫沉淀確定SPC主要調節(jié)了Aktl的活性。1.6細胞膜上的脂筏可能參與了SPC對PTEN/Akt及自噬信號的調控許多證據(jù)都表明細胞膜上的脂筏可以調控Akt的活性。Kobayashi等在SPC調節(jié)血管平滑肌細胞收縮機制的研究中提出了膽固醇對SPC信號調控的影響,進而提出脂筏可能是將胞外SPC信號傳遞到胞內的重要因素。因此,我們探究SPC是否通過脂伐來調節(jié)Akt活性以及細胞自噬。用p-環(huán)糊精預處理心肌細胞破壞膜上的脂筏,SPC抑制Akt磷酸化及誘導自噬的作用均被逆轉,該過程中伴隨PTEN磷酸化的變化,表明SPC是通過細胞膜上的脂筏傳遞信號,抑制PTEN磷酸化,從而激活其磷酸酯酶活性,抑制Akt的磷酸化,進而誘導自噬的發(fā)生。2.抑制非小細胞肺癌細胞的自噬顯著的促進SPC引起的細胞死亡2.1 SPC促進非小細胞肺癌細胞的自噬由于SPC能夠廣泛促進血管內皮細胞和心肌細胞的自噬,我們推測SPC在誘導細胞自噬方面具有廣譜性。因此我們研究了SPC對非小細胞肺癌細胞自噬的影響。Western blot檢測自噬指標LC3-Ⅱ的水平表明,在A549和H157細胞中,SPC處理組LC3-Ⅱ水平顯著的升高。自噬的抑制劑3MA預處理細胞30 min抑制了SPC誘導的自噬。而溶酶體蛋白酶抑制劑Pepstatin A預處理細胞4h阻斷自噬流,進一步加劇了SPC引起LC3-Ⅱ的升高。因此,SPC能夠促進非小細胞肺癌細胞的自噬。2.2 SPC引起非小細胞肺癌細胞的死亡自噬在腫瘤細胞的存活中扮演了雙重角色,可能促進存活,也可能引起細胞死亡。我們進一步檢測加入SPC非小細胞肺癌細胞的生長和存活情況。細胞形態(tài)變化以及SRB實驗結果表明,5μM和10 μM濃度的SPC能夠顯著引起細胞的死亡。2.3 SPC抑制非小細胞肺癌細胞凋亡為了研究SPC引起非小細胞肺癌細胞死亡的方式,我們檢測了SPC對細胞凋亡的影響。通過western blot檢測細胞凋亡蛋白PARP1的切割顯示,SPC顯著抑制了A549細胞的PARP1蛋白的切割情況。因此,SPC并不是通過細胞凋亡來誘導細胞的死亡。2.4 SPC誘導非小細胞肺癌細胞壞死我們進一步檢測SPC對細胞壞死的影響。LDH實驗表明,SPC引起A549和H157肺癌細胞上清液中乳酸脫氫酶活性的顯著升高。說明SPC可以引起細胞的壞死從而誘導細胞凋亡。2.5 SPC通過誘導自噬來抑制細胞的凋亡為了明確SPC誘導的自噬與細胞死亡的關系,我們利用自噬抑制劑3MA抑制自噬,研究SPC對細胞存活的影響。SRB實驗結果表明,抑制自噬,細胞存活率進一步降低。我們進一步檢測細胞壞死和凋亡的變化。結果表明,抑制自噬以后,SPC引起的LDH水平并沒有發(fā)生顯著變化。但是,細胞凋亡蛋白PARP1切割顯著增加。以上結果表明,SPC通過誘導自噬抑制細胞的凋亡。2.6 SPC通過Akt/mTOR信號通路誘導自噬在心肌細胞中的研究表明SPC可以通過Akt/mTOR信號促進自噬,我們進一步在非小細胞肺癌細胞中驗證該自噬調節(jié)機制。Western blot結果顯示,10μM的SPC引起p70S6K和4EBP1 (mTOR的兩個下游底物)的磷酸化水平顯著降低,5 μM和10μM的SPC引起Akt的磷酸化水平的顯著降低。因此,SPC通過抑制Akt/mTOR信號通路誘導自噬。2.7 p53參與了SPC調節(jié)的自噬SPC誘導人類臍靜脈內皮細胞中自噬的過程中,p53蛋白水平顯著下調。我們進一步探究SPC在誘導非小細胞肺癌細胞自噬過程中,p53是否也參與了該過程。我們采用了p53野生的和缺失的兩種細胞系：A549細胞和H1299細胞。實驗結果表明,SPC能夠誘導p53野生的A549細胞的自噬；卻不能誘導缺失p53的H1299細胞的自噬。這一結果說明p53可能參與SPC誘導的非小細胞肺癌細胞的自噬過程。另外,我們還檢測發(fā)現(xiàn)SPC能夠引起線粒體膜電位和ROS水平的下降。
【關鍵詞】：鞘氨醇磷酸膽堿 自噬 心肌細胞 非小細胞肺癌細胞 凋亡
【學位授予單位】：山東大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R734.2
【目錄】：

• 中文摘要5-10
• ABSTRACT10-16
• 縮略詞表16-17
• 前言17-29
• 第一部分 SPC通過脂筏/PTEN/Akt1/mTOR信號通路誘導自噬抑制心肌細胞凋亡29-51
• 前言29-40
• 結果40-43
• 討論43-45
• 附圖45-51
• 第二部分 抑制非小細胞肺癌細胞的自噬促進SPC引起的細胞死亡51-65
• 前言51-54
• 結果54-56
• 討論56-58
• 附圖58-65
• 參考文獻65-77
• 致謝77-79
• 攻讀碩士期間發(fā)表的主要學術論文目錄79-80
• 附件80

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本文編號：863006