本文關(guān)鍵詞：PAMAM-NK4納米復(fù)合物的制備及對(duì)乳腺癌體內(nèi)外生長(zhǎng)抑制的研究

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【摘要】：研究背景：乳腺癌是目前全球女性最常見的惡性腫瘤之一,其發(fā)病率在全世界范圍內(nèi)均呈現(xiàn)上升趨勢(shì),對(duì)女性的健康造成嚴(yán)重威脅。自90年代以來,中國乳腺癌發(fā)病率的增長(zhǎng)速度已經(jīng)達(dá)到了全球的兩倍多,成為中國女性惡性腫瘤發(fā)病率的第一位。隨著對(duì)基因組學(xué)、蛋白組學(xué)和分子生物學(xué)研究的不斷深入,人們已經(jīng)逐步意識(shí)到癌癥的發(fā)生與演變是多種癌基因共同作用的結(jié)果,乳腺癌的基因治療成為研究的熱點(diǎn)�；蛑委煶晒Φ臎Q定性因素是高效的基因轉(zhuǎn)染和表達(dá),因此目的基因和載體的選擇至關(guān)重要。肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子(hepatocyte growth factor, HGF)由間質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生,通過與受體c-Met結(jié)合,發(fā)生自體磷酸化,促進(jìn)腫瘤的增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移以及血管形成。有文獻(xiàn)報(bào)道HGF的高表達(dá)在乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展和侵襲、轉(zhuǎn)移中發(fā)揮了重要作用。NK4首先是作為特異性HGF拮抗劑被發(fā)現(xiàn)的,由HGF的N末端氨基酸和4個(gè)Kringle區(qū)域組成的NK4作為HGF的一部分,能夠競(jìng)爭(zhēng)性拮抗HGF與c-Met結(jié)合以及抑制新生血管生成,從而抑制腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲與轉(zhuǎn)移,具有顯著的抗腫瘤作用。已有實(shí)驗(yàn)證明NK4對(duì)胰腺癌、宮頸癌、肝癌等多種惡性腫瘤具有抗腫瘤作用,并在裸鼠動(dòng)物模型上得到驗(yàn)證。準(zhǔn)確地將目的基因?qū)肽[瘤細(xì)胞中,載體的選擇至關(guān)重要。聚酰胺-胺樹枝狀高聚合物(polyamidoamine dendrimers, PAMAM)是目前應(yīng)用最廣泛的多聚陽離子聚合物之一。其表面的氨基基團(tuán)(——NH2)可以與DNA主鏈的磷酸基團(tuán)產(chǎn)生靜電作用,形成穩(wěn)定的復(fù)合物,既提高了目的基因的轉(zhuǎn)運(yùn)效率,又提高了PAMAM-DNA納米復(fù)合物的穩(wěn)定性。此外它還具有以下優(yōu)勢(shì)：①不會(huì)因免疫原性使機(jī)體產(chǎn)生免疫反應(yīng)；②無遺傳毒性和細(xì)胞毒性；③可以保護(hù)目的基因轉(zhuǎn)染后不受機(jī)體中血漿、組織細(xì)胞中的各種補(bǔ)體以及多種酶的破壞,從而延長(zhǎng)其在細(xì)胞內(nèi)的停留和表達(dá)時(shí)間。目的：選取第5代PAMAM作為基因載體,制備PAMAM-NK4納米復(fù)合物,檢測(cè)納米復(fù)合物的轉(zhuǎn)染效率并考察其體外對(duì)乳腺癌細(xì)胞的抑制作用。建立人乳腺癌細(xì)胞裸鼠移植瘤模型,觀察PAMAM-NK4納米復(fù)合物體內(nèi)的抗癌效果,為乳腺癌基因治療的臨床研究提供理論基礎(chǔ)。方法1. PAMAM-NK4納米復(fù)合物的制備、轉(zhuǎn)染及鑒定1.1人乳腺癌MCF-7、MDA-MB-231細(xì)胞株的培養(yǎng)購買的人乳腺癌MCF-7、MDA-MB-231細(xì)胞株更換含血清的培養(yǎng)液后,放置在37℃,5% CO2培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng),顯微鏡下判斷細(xì)胞狀態(tài),定期更換培養(yǎng)液。1.2PAMAM-NK4納米復(fù)合物的制備將提純后的第5代PAMAM和重組質(zhì)粒pcDNA3.1-NK4按照5：1的電荷比置于PBS溶液中,震蕩混合15s,室溫下靜置30min。1.3轉(zhuǎn)染人乳腺癌MCF-7、MDA-MB-231細(xì)胞株制備濃度為100nmol/L的PAMAM-NK4懸液,分別取2 ml懸液轉(zhuǎn)染對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的MCF-7、MDA-MB-231細(xì)胞株,放置在孵箱中常規(guī)培養(yǎng)。4h后更換含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液,繼續(xù)培養(yǎng)。1.4體外轉(zhuǎn)染率的檢測(cè)將轉(zhuǎn)染后的兩種細(xì)胞株繼續(xù)培養(yǎng),24h后置于倒置熒光顯微鏡下觀察,綠色熒光的細(xì)胞為轉(zhuǎn)染陽性的細(xì)胞,計(jì)算轉(zhuǎn)染率。2. PAMAM-NK4納米復(fù)合物對(duì)乳腺癌細(xì)胞的體外抑制作用2.1 MTT檢測(cè)PAMAM-NK4納米復(fù)合物轉(zhuǎn)染對(duì)乳腺癌細(xì)胞增殖的抑制作用將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的MDA-MB-231、MCF-7細(xì)胞株分為對(duì)照組、空質(zhì)粒組(PAMAM組)和實(shí)驗(yàn)組(PAMAM-NK4組),每孔加入MTT溶液40μl,4h后去上清。加入150μl DMSO,震蕩10 min。測(cè)OD值,增殖抑制率(%)=(1-實(shí)驗(yàn)組OD值/對(duì)照組OD值)×100%。2.2 Western blot檢測(cè)PAMAM-NK4納米復(fù)合物轉(zhuǎn)染對(duì)乳腺癌細(xì)胞NK4蛋白表達(dá)的影響取培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期的對(duì)照組、空質(zhì)粒組和實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞,提取各組細(xì)胞蛋白,在酶標(biāo)儀上測(cè)蛋白濃度。樣品經(jīng)SDS-PAGE電泳分離總蛋白條帶、轉(zhuǎn)膜和封閉后,加入NK4一抗(人HGF單抗)4℃過夜,TBST洗3次,再加入二抗,β-actin為內(nèi)參。洗膜后顯影、掃描膠片、分析條帶的灰度值。2.3流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)PAMAM-NK4納米復(fù)合物轉(zhuǎn)染對(duì)乳腺癌細(xì)胞凋亡率的影響分別取對(duì)照組、空質(zhì)粒組和實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞制成細(xì)胞懸液,繼續(xù)培養(yǎng)24h后用胰酶消化、PBS沖洗后加入染色緩沖液重懸細(xì)胞。加入熒光標(biāo)記的Annexin V染料和PI,常溫避光孵育15min。加入染色緩沖液,用流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞周期和凋亡率。3. PAMAM-NK4納米復(fù)合物對(duì)移植瘤裸鼠模型的抗癌作用的研究3.1構(gòu)建人乳腺癌細(xì)胞移植瘤裸鼠模型制備MDA-MB-231細(xì)胞懸液,在裸鼠左側(cè)第二對(duì)乳頭脂肪墊皮下注射0.2 ml單細(xì)胞懸液(約含1×107個(gè)細(xì)胞),共接種40只裸鼠。接種后,用游標(biāo)卡尺測(cè)量皮下結(jié)節(jié)的生長(zhǎng)情況,記錄瘤體長(zhǎng)徑(a)和短徑(b),計(jì)算腫瘤體積(V)。計(jì)算公式為：V=ab2/2。3.2分組給藥并監(jiān)測(cè)PAMAM-NK4納米復(fù)合物對(duì)荷瘤鼠腫瘤生長(zhǎng)的抑制作用將荷瘤鼠按照完全隨機(jī)的原則分為4組,每組10只。對(duì)照組：腫瘤接種部位旁皮下注射0.2 ml 0.9%氯化鈉溶液；空質(zhì)粒組：腫瘤接種部位旁皮下注射0.2ml溶液,含100μg PAMAM-pcDNA3.1(-)空質(zhì)粒納米復(fù)合物；實(shí)驗(yàn)組：腫瘤接種部位旁皮下注射0.2 ml溶液,含100μg PAMAM-NK4納米復(fù)合物；陽性對(duì)照組：腹腔注射0.2 ml多柔比星溶液,含100μg多柔比星。于細(xì)胞接種第7d開始,連續(xù)給藥直至第14 d。隔天測(cè)量腫瘤長(zhǎng)短徑：計(jì)算腫瘤體積V=ab2/2。第30d處死荷瘤鼠,完整摘除腫瘤,測(cè)量瘤體體積并稱重。3.3 Western blot檢測(cè)PAMAM-NK4納米復(fù)合物對(duì)移植瘤組織NK4蛋白表達(dá)的影響取各組移植瘤組織,每組各取0.2g,剪碎、磨勻、離心后獲得細(xì)胞蛋白,測(cè)細(xì)胞蛋白濃度。經(jīng)電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉,再加入一抗、二抗孵育,分別檢測(cè)四組移植瘤組織NK4蛋白的表達(dá)情況。統(tǒng)計(jì)學(xué)處理實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行分析,計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示。組間比較如果方差齊,采用One-Way ANOVA方差分析進(jìn)行多組間比較,再用LSD進(jìn)行兩兩比較；如果方差不齊,采用Welch法進(jìn)行多組間比較,再用Dunnet's T3法進(jìn)行兩兩比較。P0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果1. PAMAM-NK4納米復(fù)合物成功轉(zhuǎn)染人乳腺癌細(xì)胞株P(guān)AMAM-NK4納米復(fù)合物轉(zhuǎn)染乳腺癌細(xì)胞株后,在倒置熒光顯微鏡下可以觀察到MDA-MB-231、MCF-7細(xì)胞內(nèi)均有綠色熒光蛋白的表達(dá),MDA-MB-231細(xì)胞蛋白表達(dá)量更高。自轉(zhuǎn)染后24h開始出現(xiàn)綠色熒光,之后漸漸增多,于48h達(dá)到頂峰,72h后熒光強(qiáng)度逐漸減弱。2. PAMAM-NK4納米復(fù)合物對(duì)人乳腺癌細(xì)胞增殖能力的抑制作用MTT檢測(cè)結(jié)果提示,空質(zhì)粒組和對(duì)照組細(xì)胞相比增殖能力無顯著性差異。與對(duì)照組相比,實(shí)驗(yàn)組MDA-MB-231 [(0.27±0.06) vs (0.54±0.06)]、 MCF-7[(0.30±0.05) vs (0.43±0.05)]細(xì)胞OD值均顯著下降,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P0.05)。兩種細(xì)胞株進(jìn)行對(duì)比,MDA-MB-231細(xì)胞的抑制率為50.4%,明顯高于MCF-7細(xì)胞(30.6%),差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.01)。3. PAMAM-NK4納米復(fù)合物轉(zhuǎn)染對(duì)人乳腺癌細(xì)胞中NK4蛋白表達(dá)的影響Western blot檢測(cè)結(jié)果提示,對(duì)照組MDA-MB-231、MCF-7細(xì)胞均有少量HGF表達(dá)(即內(nèi)源性NK4蛋白),表達(dá)的平均值分別為：(0.88±0.03)和(0.35±0.01)。轉(zhuǎn)染后空質(zhì)粒組和對(duì)照組相比無明顯差異(P0.05)。實(shí)驗(yàn)組兩株細(xì)胞NK4蛋白表達(dá)的平均值分別為：(2.26±0.02)和(1.26±0.01)。實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組相比兩株細(xì)胞NK4蛋白的表達(dá)顯著升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),且MDA-MB-231細(xì)胞中NK4蛋白表達(dá)水平更高。4. PAMAM-NK4納米復(fù)合物轉(zhuǎn)染提高人乳腺癌細(xì)胞凋亡率空質(zhì)粒組和對(duì)照組相比差異無顯著差異(P0.05)。實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組相比,細(xì)胞凋亡率百分比的差異如下：MDA-MB-231細(xì)胞[(2.9±0.04)%vs(2.26±0.06)%]、MCF-7細(xì)胞[(2.9±0.06)% vs(2.40±0.04)%],實(shí)驗(yàn)組凋亡率明顯高于對(duì)照組,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。5. PAMAM-NK4納米復(fù)合物抑制荷瘤鼠腫瘤的生長(zhǎng)接種1周后,接種處肉眼均可見皮下結(jié)節(jié),腫物生長(zhǎng)緩慢,接種處皮膚無紅腫、破潰。成瘤率為100%,各組裸鼠的一般情況可,生活習(xí)性無明顯改變。第30d完整摘除腫瘤,對(duì)照組、空質(zhì)粒組、實(shí)驗(yàn)組和陽性對(duì)照組腫瘤體積分別為(2.42±0.62)cm3、(2.38±0.64)cm3、(1.5±0.43)cm3和(1.64±0.31)cm3；腫瘤質(zhì)量分別為：(3.86±1.12)g、(3.48±1.07)g、(1.41±0.47)g和(1.56±0.38)g。腫瘤體積和質(zhì)量在對(duì)照組和空質(zhì)粒組之間無顯著性差異(P0.05),實(shí)驗(yàn)組和陽性對(duì)照組腫瘤體積及質(zhì)量明顯低于對(duì)照組,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),可見腫瘤生長(zhǎng)被顯著抑制。實(shí)驗(yàn)組和陽性對(duì)照組相比,無顯著性差異(P0.05)。6. PAMAM-NK4納米復(fù)合物轉(zhuǎn)染對(duì)移植瘤組織NK4蛋白表達(dá)的影響對(duì)照組和空質(zhì)粒組蛋白表達(dá)均有少量?jī)?nèi)源性NK4蛋白。對(duì)照組NK4蛋白表達(dá)平均值為(0.8±0.05)；空質(zhì)粒組和陽性對(duì)照組和對(duì)照組比較,蛋白的表達(dá)量無顯著差異(P0.05)。而轉(zhuǎn)染PAMAM-NK4納米復(fù)合物的實(shí)驗(yàn)組NK4蛋白表達(dá)平均值為(3.44+0.07),與對(duì)照組比較蛋白表達(dá)量大幅度升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。結(jié)論1. PAMAM-NK4納米復(fù)合物能夠成功轉(zhuǎn)染兩種乳腺癌細(xì)胞,表達(dá)NK4蛋白,抑制乳腺癌細(xì)胞增殖、促進(jìn)細(xì)胞凋亡,發(fā)揮抗癌作用。其中納米復(fù)合物對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞株的轉(zhuǎn)染效率更高、抑制作用更強(qiáng)。2.通過皮下注射乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞懸液的方法成功制備移植型乳腺癌裸鼠模型,成瘤率100%。PAMAM-NK4納米復(fù)合物轉(zhuǎn)染后能夠在腫瘤組織中成功表達(dá)NK4蛋白,顯著抑制腫瘤的生長(zhǎng)。納米復(fù)合物和化療藥物多柔比星均顯著抑制腫瘤生長(zhǎng),兩者抑瘤效果無顯著性差異。
【關(guān)鍵詞】：乳腺癌 基因治療 聚酰胺-胺樹枝狀高聚合物 NK4
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R737.9
【目錄】：

• 摘要3-9
• ABSTRACT9-19
• 第一部分 PAMAM-NK4納米復(fù)合物的制備及對(duì)乳腺癌細(xì)胞的體外抑制作用19-48
• 第一章 前言19-33
• 第二章 材料與方法33-42
• 第三章 結(jié)果42-45
• 第四章 討論45-47
• 第五章 結(jié)論47-48
• 第二部分 PAMAM-NK4納米復(fù)合物對(duì)移植瘤裸鼠模型的作用研究48-58
• 第一章 前言48-51
• 第二章 材料與方法51-53
• 第三章 結(jié)果53-56
• 第四章 討論56-57
• 第五章 結(jié)論57-58
• 不足和展望58-59
• 參考文獻(xiàn)59-69
• 攻讀碩士學(xué)位期間發(fā)表論文69-70
• 致謝70-72

【相似文獻(xiàn)】

中國碩士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫 前1條

1 延艷;PAMAM-NK4納米復(fù)合物的制備及對(duì)乳腺癌體內(nèi)外生長(zhǎng)抑制的研究[D];南方醫(yī)科大學(xué);2016年

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本文編號(hào)：856218