本文關(guān)鍵詞：組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶EZH2在力達(dá)霉素等藥物誘導(dǎo)人結(jié)腸癌細(xì)胞衰老中的作用及機(jī)制研究

  更多相關(guān)文章： 結(jié)腸癌 細(xì)胞衰老 LDM EZH2 DZNep 抗腫瘤

【摘要】：背景和目的：結(jié)腸癌(Colon cancer)是世界第三大惡性腫瘤,具有很高的發(fā)病率及死亡率。腫瘤發(fā)生的主要事件是腫瘤細(xì)胞逃逸衰老和死亡程序而進(jìn)入永生化,因此誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞重獲衰老特征及誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡是抑制腫瘤生長(zhǎng)和增殖的重要途徑。越來(lái)越多的研究證明,表觀遺傳調(diào)控在結(jié)腸癌的發(fā)生發(fā)展中起著重要的作用。組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶EZH2 (Enhancer of zeste homolog 2)是表觀遺傳調(diào)控蛋白PRC2家族的核心成員,通過(guò)三甲基化H3K27 (H3K27me3)進(jìn)而發(fā)揮對(duì)靶基因的轉(zhuǎn)錄沉默作用。細(xì)胞衰老是公認(rèn)的抗腫瘤作用機(jī)制之一,研究發(fā)現(xiàn),抑制EZH2的表達(dá)能夠誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞衰老,然而,EZH2在烯二炔類DNA損傷藥物誘導(dǎo)的結(jié)腸癌細(xì)胞衰老中的作用至今尚不清楚。本研究選用人結(jié)腸癌細(xì)胞作為研究對(duì)象,擬用高效抗腫瘤烯二炔藥物力達(dá)霉素(Lidamycin, LDM)觀察其對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞中EZH2的表達(dá)是否有影響,以及EZH2在力達(dá)霉素誘導(dǎo)細(xì)胞衰老中的作用及機(jī)制。在此基礎(chǔ)上,本研究還采用EZH2抑制劑DZNep作用結(jié)腸癌細(xì)胞來(lái)觀察DZNep能否誘導(dǎo)結(jié)腸癌細(xì)胞衰老。方法：MTT法、細(xì)胞生長(zhǎng)曲線測(cè)定及克隆形成實(shí)驗(yàn)法檢測(cè)上述藥物對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞增殖活力及克隆形成能力的影響；SA-β-Gal染色檢測(cè)細(xì)胞衰老表型；PI染色結(jié)合流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期分布；Annexin Ⅴ Alexa Fluor488/PI雙染結(jié)合流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)凋亡細(xì)胞比例；雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)p21啟動(dòng)子區(qū)的活性；蛋白免疫印跡和實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)各蛋白水平和mRNA水平的變化；流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)DNA損傷標(biāo)志物γ-H2AX的含量變化；免疫組化實(shí)驗(yàn)檢測(cè)人結(jié)腸癌組織樣本中EZH2和細(xì)胞衰老相關(guān)蛋白p21的表達(dá)；siRNA敲低EZH2表達(dá)以及構(gòu)建慢病毒表達(dá)載體過(guò)表達(dá)EZH2,檢測(cè)其對(duì)LDM所致細(xì)胞增殖、周期及衰老作用的影響。siRNA敲低p21表達(dá),檢測(cè)對(duì)LDM誘導(dǎo)細(xì)胞周期、細(xì)胞凋亡及細(xì)胞衰老作用的影響。染色質(zhì)免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)檢測(cè)EZH2蛋白與p21啟動(dòng)子區(qū)的結(jié)合作用。結(jié)果：一、EZH2與LDM誘導(dǎo)人結(jié)腸癌細(xì)胞衰老的關(guān)系研究LDM對(duì)HCT116和SW620細(xì)胞有明顯抑制增殖活力及克隆形成能力的作用。SA-β-Gal染色觀察到IC50濃度范圍(0.5 nM) LDM作用48 h-120 h可以明顯誘導(dǎo)HCT116和SW620細(xì)胞發(fā)生細(xì)胞衰老,并且該衰老樣表型具有不可逆性。0.5 nMLDM作用時(shí)間依賴性誘導(dǎo)細(xì)胞G2/M期周期阻滯及細(xì)胞凋亡,同時(shí)DNA損傷標(biāo)志物y-H2AX含量明顯增加。LDM可明顯抑制H3K2、H3K27me3及PRC2成員蛋白的表達(dá)水平并上調(diào)衰老相關(guān)蛋白p21的表達(dá)水平,其中對(duì)EZH2、H3K27me3及PRC2成員蛋白的抑制作用具有劑量依賴性和時(shí)間依賴性；LDM對(duì)EZH2蛋白表達(dá)的抑制作用與其mRNA水平變化有關(guān)。雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)發(fā)現(xiàn)LDM可顯著增加p21啟動(dòng)子區(qū)的活性。siRNA敲低EZH2表達(dá)后可誘導(dǎo)上述細(xì)胞發(fā)生衰老及G2/M細(xì)胞周期阻滯等類似現(xiàn)象。免疫組化結(jié)果顯示EZH2在人結(jié)腸癌癌組織中的表達(dá)普遍高于癌旁組織。通過(guò)在HCT1 16細(xì)胞中過(guò)表達(dá)EZH2, LDM對(duì)p21啟動(dòng)子的激活作用和p21蛋白表達(dá)上調(diào)作用均受到抑制,DNA損傷標(biāo)志物γ-H2AX含量下降。siRNA敲低p21的表達(dá)可顯著逆轉(zhuǎn)LDM誘導(dǎo)的細(xì)胞衰老。染色質(zhì)免疫共沉淀結(jié)果顯示,LDM作用SW620細(xì)胞72 h后能夠顯著降低EZH2及H3K27me3在p21啟動(dòng)子區(qū)的富集。二、DZNep誘導(dǎo)人結(jié)腸癌細(xì)胞HCT116細(xì)胞衰老的機(jī)制研究DZNep在IC50范圍內(nèi)(5μM)對(duì)HCT116細(xì)胞有明顯抑制增殖活力及克隆形成能力的作用。SA-β-Gal染色觀察到DZNep (5μM)作用48h-120h能夠誘導(dǎo)細(xì)胞衰老,同時(shí)通過(guò)siRNA干擾EZH2的表達(dá)也能觀察到衰老染色陽(yáng)性細(xì)胞。5μMDZNep作用24 h-72 h能夠誘導(dǎo)細(xì)胞G2/M周期阻滯及細(xì)胞凋亡。DZNep作用48h-120 h能夠時(shí)間依賴性抑制EZH2、EED、SUZ12蛋白表達(dá),上調(diào)細(xì)胞周期調(diào)控蛋白p21、p27蛋白表達(dá),并下調(diào)p-RB和p-cdc2蛋白的表達(dá)。Western Blot檢測(cè)到凋亡標(biāo)志蛋白PARP切割。結(jié)論：本研究中,我們首次發(fā)現(xiàn)在結(jié)腸癌細(xì)胞中LDM能夠抑制EZH2及其他PRC2家族成員以及甲基化組蛋白H3K27me3的表達(dá),證明了LDM通過(guò)抑制EZH2的表達(dá),解除對(duì)p21啟動(dòng)子區(qū)的抑制作用并上調(diào)p21蛋白的表達(dá),激活細(xì)胞衰老信號(hào)通路進(jìn)而誘導(dǎo)結(jié)腸癌細(xì)胞衰老。而在EZH2抑制劑DZNep抑制結(jié)腸癌生長(zhǎng)增殖的作用機(jī)制研究中,我們首次發(fā)現(xiàn)了DZNep能夠誘導(dǎo)結(jié)腸癌細(xì)胞衰老。本研究首次為EZH2與烯二炔抗腫瘤抗生素誘導(dǎo)結(jié)腸癌細(xì)胞衰老之間的表觀遺傳調(diào)控機(jī)制提供了證據(jù),并為以EZH2為靶點(diǎn)進(jìn)行抗結(jié)腸癌治療提供了新思路。
【關(guān)鍵詞】：結(jié)腸癌 細(xì)胞衰老 LDM EZH2 DZNep 抗腫瘤
【學(xué)位授予單位】：北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R735.35
【目錄】：

• 中文摘要6-8
• Abstract8-10
• 縮略語(yǔ)10-12
• 第一部分：EZH2與LDM誘導(dǎo)人結(jié)腸癌細(xì)胞衰老的關(guān)系研究12-58
• 前言12-15
• 材料與方法15-26
• 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析26-48
• 1. EZH2基因在人結(jié)腸癌組織及結(jié)腸癌細(xì)胞系中的表達(dá)情況26-28
• 1.1 EZH2在人結(jié)腸癌組織中的表達(dá)情況26-27
• 1.2 EZH2在結(jié)腸癌患者中的生存期分析27
• 1.3 EZH2在人結(jié)腸癌細(xì)胞系中的表達(dá)情況27-28
• 2. LDM對(duì)EZH2及PRC2家族成員的作用28-31
• 2.1 LDM在蛋白水平對(duì)EZH2及PRC2家族成員作用28-30
• 2.2 LDM在mRNA水平對(duì)EZH2的作用30
• 2.3 LDM在其他腫瘤細(xì)胞系對(duì)EZH2的作用30-31
• 3. LDM對(duì)人結(jié)腸癌細(xì)胞增殖的作用31-36
• 3.1 LDM對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞生長(zhǎng)增殖的作用31-32
• 3.2 LDM對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞周期分布的影響32-34
• 3.3 LDM誘導(dǎo)結(jié)腸癌細(xì)胞凋亡34-35
• 3.4 LDM誘導(dǎo)結(jié)腸癌細(xì)胞衰老35-36
• 4. LDM誘導(dǎo)人結(jié)腸癌細(xì)胞衰老的機(jī)制研究36-39
• 4.1 LDM誘導(dǎo)細(xì)胞衰老的相關(guān)蛋白表達(dá)情況36
• 4.2 LDM不依賴p53蛋白誘導(dǎo)人結(jié)腸癌細(xì)胞衰老36-37
• 4.3 LDM誘導(dǎo)的結(jié)腸癌細(xì)胞衰老具有不可逆性37-39
• 5. EZH2在LDM誘導(dǎo)細(xì)胞衰老中的作用39-42
• 5.1 干擾EZH2的表達(dá)對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞衰老的影響39-40
• 5.2 過(guò)表達(dá)EZH2對(duì)LDM誘導(dǎo)細(xì)胞衰老的影響40-42
• 5.3 EZH2對(duì)LDM誘導(dǎo)細(xì)胞DNA損傷的影響42
• 6. EZH2參與LDM對(duì)p21調(diào)控的分子機(jī)制42-48
• 6.1 p21在人結(jié)腸癌組織中的表達(dá)情況43-44
• 6.2 LDM依賴p21信號(hào)通路誘導(dǎo)HCT116細(xì)胞衰老44-45
• 6.3 EZH2參與LDM對(duì)p21蛋白水平的調(diào)控45
• 6.4 EZH2參與LDM對(duì)p21啟動(dòng)子區(qū)的活性調(diào)節(jié)45-46
• 6.5 EZH2調(diào)控p21啟動(dòng)子區(qū)的組蛋白甲基化46-48
• 討論48-52
• 參考文獻(xiàn)52-57
• 論文結(jié)論57-58
• 第二部分：DZNep誘導(dǎo)人結(jié)腸癌細(xì)胞HCT116細(xì)胞衰老的機(jī)制研究58-71
• 前言58-60
• 材料與方法60-61
• 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析61-66
• 1. DZNep對(duì)HCT116細(xì)胞的生長(zhǎng)增殖抑制作用61-62
• 2. DZNep誘導(dǎo)HCT116細(xì)胞G1期周期阻滯62
• 3. DZNep誘導(dǎo)HCT116細(xì)胞衰老62-63
• 4. DZNep對(duì)HCT116細(xì)胞周期相關(guān)蛋白表達(dá)的影響63-64
• 5. DZNep誘導(dǎo)HCT116細(xì)胞凋亡64-66
• 討論66-68
• 參考文獻(xiàn)68-70
• 論文結(jié)論70-71
• 文獻(xiàn)綜述71-87
• 參考文獻(xiàn)82-87
• 個(gè)人簡(jiǎn)歷87-88
• 附錄88-91
• 致謝91

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