本文關(guān)鍵詞：Gli-2在膀胱癌中的表達(dá)和意義及對T24細(xì)胞VEGF和MMP-9表達(dá)的影響

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【摘要】：目的:通過檢測Hedgehog信號通路關(guān)鍵基因Gli-2蛋白在膀胱癌組織中的表達(dá),研究其與膀胱癌臨床病理特征之間的關(guān)系;探討Gli-2在膀胱癌T24細(xì)胞增殖中的作用及其機(jī)制,以及對血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)和基質(zhì)金屬蛋白酶-9(matrix metalloproteinase-9,MMP-9)蛋白表達(dá)的影響。方法:(1)應(yīng)用免疫組織化學(xué)方法檢測77例膀胱癌組織中Gli-2的表達(dá)。(2)應(yīng)用小干擾RNA(siRNA)下調(diào)Gli-2在膀胱癌T24細(xì)胞系中的表達(dá),分別提取總RNA和蛋白質(zhì)。使用RT-PCR方法檢測Gli-2的mRNA表達(dá),Western-blot方法分析Gli-2,VEGF和MMP-9蛋白的表達(dá)。分別應(yīng)用CCK-8法和流式細(xì)胞術(shù)檢測下調(diào)Gli-2表達(dá)對細(xì)胞增殖、凋亡和細(xì)胞周期的影響。結(jié)果:(1)在77例膀胱癌中,77例均有不同程度的Gli-2陽性表達(dá),陽性率為100.0%。Gli-2的表達(dá)與病理分期密切相關(guān),隨病理分期的升高,評分亦高(P0.001),且在肌層浸潤性膀胱癌中的表達(dá)明顯高于非肌層浸潤性膀胱癌(P0.001),Gli-2的表達(dá)與病理分級不相關(guān),兩者僅有邊緣性意義(P=0.052)。(2)在T24細(xì)胞中應(yīng)用siRNA沉默Gli-2表達(dá)后,實驗組細(xì)胞的Gli-2基因的mRNA表達(dá)水平明顯下降,與對照組相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=-3.031,P0.05)。Gli-2蛋白的表達(dá)明顯下調(diào)。此外,VEGF和MMP-9蛋白的表達(dá)較對照組均降低。CCK-8法檢測結(jié)果顯示實驗組細(xì)胞增殖被顯著抑制,其P值均0.001。流式細(xì)胞儀檢測RNA干擾后48h的細(xì)胞周期情況,發(fā)現(xiàn)實驗組有(27.8±2.1)%的細(xì)胞被阻滯于G2/M期,而對照組G2/M期細(xì)胞只有(6.61±1.1)%,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。Gli-2基因表達(dá)被沉默后,T24細(xì)胞細(xì)胞凋亡率為(11.63±1.09)%,較對照組(3.43±1.05)%顯著升高,凋亡增加,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=4.015,P0.05)。結(jié)論:Gli-2蛋白在膀胱癌組織中的表達(dá)與病理分期密切相關(guān),且在肌層浸潤性膀胱癌中表達(dá)明顯升高。抑制Gli-2的表達(dá)可抑制膀胱癌細(xì)胞增殖,誘導(dǎo)凋亡,提示Gli-2參與了膀胱癌的發(fā)生發(fā)展,有可能成為新的膀胱癌的治療靶點(diǎn)。
【關(guān)鍵詞】：膀胱癌 Gli-2基因 VEGF MMP-9 細(xì)胞增殖
【學(xué)位授予單位】：青島大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R737.14
【目錄】：

• 摘要2-4
• Abstract4-9
• 引言9-12
• 第一章 材料及方法12-25
• 1.1 實驗材料12-15
• 1.1.1 研究對象12
• 1.1.2 細(xì)胞來源12
• 1.1.3 主要試劑12-14
• 1.1.4 主要器材、儀器14-15
• 1.2 實驗方法15-25
• 1.2.1 免疫組化染色15-16
• 1.2.1.1 石蠟切片的制作15
• 1.2.1.2 免疫組化SP法15-16
• 1.2.1.3 結(jié)果分析與判斷16
• 1.2.2 細(xì)胞培養(yǎng)16-18
• 1.2.2.1 細(xì)胞復(fù)蘇16-17
• 1.2.2.2 細(xì)胞培養(yǎng)17
• 1.2.2.3 細(xì)胞傳代17
• 1.2.2.4 細(xì)胞凍存17-18
• 1.2.3 實驗分組及siRNA轉(zhuǎn)染18
• 1.2.3.1 實驗分組18
• 1.2.3.2 siRNA轉(zhuǎn)染18
• 1.2.4 RT-PCR方法檢測實驗組和對照組T24細(xì)胞內(nèi)Gli-2 的mRNA表達(dá)18-20
• 1.2.4.1 膀胱癌T24細(xì)胞總RNA提取18-19
• 1.2.4.2 逆轉(zhuǎn)錄19-20
• 1.2.4.3 Gli-2 編碼序列引物的設(shè)計20
• 1.2.4.4 Real time PCR擴(kuò)增Gli-2 編碼序列20
• 1.2.5 Western-blot方法分析Gli-2，VEGF和MMP-9 蛋白的表達(dá)20-23
• 1.2.5.1 細(xì)胞蛋白樣品的制備21
• 1.2.5.2 蛋白濃度的測定21
• 1.2.5.3 Western blot檢測蛋白表達(dá)21-23
• 1.2.6 CCK-8 法檢測T24細(xì)胞增殖情況23
• 1.2.7 細(xì)胞周期和凋亡的檢測23-24
• 1.2.8 統(tǒng)計分析24-25
• 第二章 實驗結(jié)果25-34
• 2.1 免疫組化檢測結(jié)果25-27
• 2.2 Gli-2 膀胱癌細(xì)胞株中的表達(dá)及意義27-28
• 2.3 . 小干擾 RNA 沉默 Gli-2 基因效果的驗證28-29
• 2.4 實驗組和對照組 T24 細(xì)胞內(nèi) Gli-2 的 m RNA 表達(dá)情況29-30
• 2.5 實驗組和對照組 T24 細(xì)胞中 Gli-2，VEGF 和 MMP-9 蛋白的表達(dá)情況30-31
• 2.6 實驗組和對照組膀胱癌 T24 細(xì)胞的增殖情況31-32
• 2.7 Gli-2 基因表達(dá)下調(diào)對膀胱癌 T24 細(xì)胞的細(xì)胞周期和凋亡的影響32-34
• 第三章 討論34-36
• 第四章 結(jié)論36-37
• 參考文獻(xiàn)37-40
• 綜述40-51
• 綜述的參考文獻(xiàn)46-51
• 攻讀學(xué)位期間的研究成果51-52
• 致謝52-53

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本文編號：853288