本文關(guān)鍵詞：miR-185調(diào)控肝癌細(xì)胞侵襲遷移的分子機(jī)制

  更多相關(guān)文章： miR-185 肝癌細(xì)胞 增殖 侵襲 遷移

【摘要】：目的探討miR-185在人肝癌細(xì)胞和正常肝細(xì)胞中的差異表達(dá)以及miR-185對(duì)肝癌細(xì)胞生長增殖、侵襲和遷移能力的影響,并確定miR-185直接作用的靶基因,以期為肝癌發(fā)生發(fā)展、侵襲轉(zhuǎn)移的具體分子機(jī)制提供理論依據(jù),并為肝癌的早期診斷和發(fā)現(xiàn)治療性靶標(biāo)提供理論基礎(chǔ)。方法1構(gòu)建miR-185過表達(dá)載體pc DNA3/pri-miR-185,合成miR-185的反義寡聚核苷酸miR-185 ASO(ASO-185),然后經(jīng)脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染人肝癌細(xì)胞系Hep G2和SMMC-7721,實(shí)驗(yàn)分為四組,轉(zhuǎn)染pc DNA3/pri-miR-185質(zhì)粒組(miR-185組)、轉(zhuǎn)染pc DNA3空載質(zhì)粒組(pc DNA3組)、轉(zhuǎn)染ASO-185組(ASO-185組)和轉(zhuǎn)染亂序寡聚核苷酸組(ASO-NC)。2實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)檢測過表達(dá)miR-185以及miR-185功能受抑制后肝癌細(xì)胞Hep G2中miR-185 m RNA表達(dá)水平的變化。3運(yùn)用CCK-8和細(xì)胞克隆形成實(shí)驗(yàn)觀察miR-185對(duì)肝癌細(xì)胞系Hep G2和SMMC-7721增殖能力的影響。4采用Transwell小室實(shí)驗(yàn)觀察miR-185對(duì)肝癌細(xì)胞系Hep G2和SMMC-7721侵襲和遷移能力的影響。5生物信息學(xué)數(shù)據(jù)庫預(yù)測結(jié)合基因芯片結(jié)果確定miR-185的侯選靶基因NR1D1并利用熒光報(bào)告載體實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證miR-185對(duì)靶基因的直接調(diào)控作用。6利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR和Western blotting技術(shù)檢測過表達(dá)miR-185以及miR-185功能受抑制后肝癌細(xì)胞系Hep G2和SMMC-7721中靶基因NR1D1 m RNA和蛋白表達(dá)水平的變化。結(jié)果1實(shí)時(shí)熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,在肝癌細(xì)胞Hep G2中過表達(dá)miR-185后,與pc DNA3組比較,miR-185組細(xì)胞中miR-185 m RNA表達(dá)水平升高,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.01);封閉細(xì)胞中內(nèi)源性miR-185的功能后,與ASO-NC組比較,ASO-185組細(xì)胞中miR-185 m RNA表達(dá)水平降低,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.01)。2 CCK-8實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,在肝癌細(xì)胞系Hep G2和SMMC-7721中過表達(dá)miR-185后,與pc DNA3組比較,miR-185組細(xì)胞增殖減慢,差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.01);封閉細(xì)胞中內(nèi)源性miR-185的功能后,與ASO-NC組比較,ASO-185組細(xì)胞增殖加快,差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.01)。3細(xì)胞克隆形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,在肝癌細(xì)胞系Hep G2和SMMC-7721中過表達(dá)miR-185后,與pc DNA3組比較,miR-185組細(xì)胞克隆形成能力下降,差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.01);封閉細(xì)胞中內(nèi)源性miR-185的功能后,與ASO-NC組比較,ASO-185組細(xì)胞克隆形成能力增強(qiáng),差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.01)。4 Transwell小室實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,在Hep G2和SMMC-7721中過表達(dá)miR-185后,與pc DNA3組相比,miR-185組細(xì)胞侵襲和遷移能力明顯降低,差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.01);封閉細(xì)胞中內(nèi)源性miR-185的功能后,與ASO-NC組比較,ASO-185組細(xì)胞侵襲和遷移能力明顯增強(qiáng),差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.01)。5生物信息學(xué)數(shù)據(jù)庫預(yù)測結(jié)合基因芯片、熒光報(bào)告載體實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證,NR1D1是miR-185的直接靶基因。6在Hep G2和SMMC-7721中過表達(dá)miR-185后,與pc DNA3組比較,miR-185組細(xì)胞中NR1D1 m RNA和蛋白的表達(dá)水平降低,差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.01);封閉細(xì)胞中內(nèi)源性miR-185的功能后,與ASO-NC組比較,ASO-185組細(xì)胞中NR1D1 m RNA和蛋白的表達(dá)水平升高,差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.01)。結(jié)論1 miR-185抑制肝癌細(xì)胞系Hep G2和SMMC-7721的增殖和克隆形成能力。2 miR-185抑制肝癌細(xì)胞系Hep G2和SMMC-7721的侵襲和遷移能力。3 miR-185可以負(fù)性調(diào)節(jié)Hep G2和SMMC-7721中NR1D1 m RNA和蛋白的表達(dá)水平,提示NR1D1是miR-185的直接靶基因,miR-185可能通過靶定NR1D1起到抑癌基因的作用。
【關(guān)鍵詞】：miR-185 肝癌細(xì)胞 增殖 侵襲 遷移
【學(xué)位授予單位】：華北理工大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R735.7
【目錄】：

• 摘要4-6
• Abstract6-11
• 英文縮略表11-13
• 引言13-15
• 第1章 miR-185對(duì)肝癌細(xì)胞增殖、侵襲及遷移能力的影響15-29
• 1.1 實(shí)驗(yàn)材料和儀器15-16
• 1.1.1 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞系和質(zhì)粒15
• 1.1.2 實(shí)驗(yàn)試劑15-16
• 1.1.3 實(shí)驗(yàn)儀器16
• 1.2 實(shí)驗(yàn)方法16-20
• 1.2.1 qRT-PCR檢測miR-185 mRNA的表達(dá)水平16-18
• 1.2.2 CCK-8 實(shí)驗(yàn)檢測肝癌細(xì)胞的增殖能力18-19
• 1.2.3 集落形成實(shí)驗(yàn)檢測肝癌細(xì)胞的集落形成能力19-20
• 1.2.4 Transwell實(shí)驗(yàn)檢測肝癌細(xì)胞的侵襲和遷移能力20
• 1.2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理20
• 1.3 結(jié)果20-25
• 1.3.1 過表達(dá)或封閉細(xì)胞中內(nèi)源性miR-185后肝癌細(xì)胞中miR-185的表達(dá)水平20-22
• 1.3.2 miR-185對(duì)肝癌細(xì)胞HepG2和SMMC-7721增殖能力的影響22-23
• 1.3.3 miR-185對(duì)肝癌細(xì)胞HepG2和SMMC-7721集落形成能力的影響23
• 1.3.4 miR-185對(duì)肝癌細(xì)胞HepG2和SMMC-7721侵襲能力的影響23-24
• 1.3.5 miR-185對(duì)肝癌細(xì)胞HepG2和SMMC-7721遷移能力的影響24-25
• 1.4 討論25-27
• 1.5 小結(jié)27-29
• 第2章 確定miR-185在肝癌細(xì)胞中的靶基因29-51
• 2.1 實(shí)驗(yàn)試劑和儀器29-31
• 2.1.1 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞系29
• 2.1.2 實(shí)驗(yàn)試劑29-30
• 2.1.3 實(shí)驗(yàn)儀器30-31
• 2.2 實(shí)驗(yàn)方法31-41
• 2.2.1 qRT-PCR檢測細(xì)胞中miR-185和NR1D1 mRNA的表達(dá)水平31-33
• 2.2.2 Western blotting檢測細(xì)胞中NR1D1蛋白的表達(dá)水平33-34
• 2.2.3 miR-185候選靶基因的篩選34-35
• 2.2.4 熒光報(bào)告載體的構(gòu)建35-39
• 2.2.5 熒光報(bào)告載體實(shí)驗(yàn)39-40
• 2.2.6 qRT-PCR檢測miR-185對(duì)肝癌細(xì)胞中NR1D1 mRNA表達(dá)水平的影響40
• 2.2.7 Western blotting檢測miR-185對(duì)肝癌細(xì)胞中NR1D1蛋白表達(dá)水平的影響40-41
• 2.2.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理41
• 2.3 結(jié)果41-48
• 2.3.1 LO2、HepG2和SMMC-7721細(xì)胞中miR-185和NR1D1 mRNA的表達(dá)水平41-42
• 2.3.2 LO2、HepG2和SMMC-7721細(xì)胞中NR1D1蛋白的表達(dá)水平42-43
• 2.3.3 miR-185候選靶基因的篩選43
• 2.3.4 熒光報(bào)告載體的構(gòu)建43-45
• 2.3.5 熒光報(bào)告載體實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證NR1D1是miR-185的直接靶基因45
• 2.3.6 miR-185對(duì)肝癌細(xì)胞中NR1D1 mRNA表達(dá)水平的影響45-48
• 2.3.7 miR-185對(duì)肝癌細(xì)胞中NR1D1蛋白表達(dá)水平的影響48
• 2.4 討論48-50
• 2.5 小結(jié)50-51
• 參考文獻(xiàn)51-55
• 第3章 綜述microRNA與肝癌關(guān)系的研究進(jìn)展55-68
• 3.1 肝癌的研究現(xiàn)狀55
• 3.2 miRNA與腫瘤的關(guān)系55-56
• 3.3 miRNA的生物合成56-57
• 3.4 miRNA與肝細(xì)胞癌57-58
• 3.5 具有癌基因作用的miRNA58-59
• 3.5.1 miR-2158
• 3.5.2 miR-2558
• 3.5.3 miR-221和miR-22258-59
• 3.5.4 miR-22459
• 3.6 具有抑癌基因作用的miRNA59-62
• 3.6.1 miR-159-60
• 3.6.2 miR-2660-61
• 3.6.3 miR-12261-62
• 3.6.4 miR-37562
• 3.7 小結(jié)62-63
• 參考文獻(xiàn)63-68
• 結(jié)論68-69
• 致謝69-70
• 導(dǎo)師簡介一70-71
• 導(dǎo)師簡介二71-72
• 作者簡介72-73
• 學(xué)位論文數(shù)據(jù)集73

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