天堂国产午夜亚洲专区-少妇人妻综合久久蜜臀-国产成人户外露出视频在线-国产91传媒一区二区三区

當(dāng)前位置:主頁 > 醫(yī)學(xué)論文 > 腫瘤論文 >

CD44啟動子對結(jié)直腸癌CD44陽性表達(dá)調(diào)控機(jī)制的研究

發(fā)布時間:2017-09-13 17:09

  本文關(guān)鍵詞:CD44啟動子對結(jié)直腸癌CD44陽性表達(dá)調(diào)控機(jī)制的研究


  更多相關(guān)文章: CD44啟動子 DNA結(jié)合蛋白 結(jié)直腸癌 電泳遷移率改變分析


【摘要】:目的:CD44異常表達(dá)是結(jié)直腸癌形成及發(fā)展的重要因素。CD44作為細(xì)胞黏附分子,在結(jié)直腸癌中表達(dá),可介導(dǎo)及參與腫瘤的生成及轉(zhuǎn)移。鑒于CD44表達(dá)在結(jié)直腸癌發(fā)生、發(fā)展過程中的重要作用,研究結(jié)直腸癌中CD44的表達(dá)調(diào)控機(jī)制對揭示結(jié)直腸癌的發(fā)生發(fā)展機(jī)理及防治腫瘤復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移有著重要意義。但目前對結(jié)直腸癌CD44異常表達(dá)調(diào)控的研究報道甚少。本研究通過檢測分析CD44啟動子DNA結(jié)合蛋白對結(jié)直腸癌CD44表達(dá)的調(diào)控作用,探討CD44啟動子與結(jié)合蛋白的相關(guān)作用,并尋找在其中發(fā)揮調(diào)控作用的蛋白或蛋白群,從而在轉(zhuǎn)錄水平查證CD44啟動子結(jié)合蛋白對CD44表達(dá)的激活和調(diào)控作用以及對結(jié)直腸癌生物學(xué)行為的影響,為揭示結(jié)直腸癌的發(fā)生發(fā)展機(jī)理及復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的防治奠定基礎(chǔ),也為結(jié)直腸癌的基因治療提供實驗依據(jù)以及潛在的治療靶點。方法:CD44啟動子甲基化驗證:分別從陰性和陽性淋巴細(xì)胞和LOVO(人結(jié)腸癌細(xì)胞)細(xì)胞中提取基因組DNA提取→亞硫酸氫鹽處理→BSP引物設(shè)計合成→PCR擴(kuò)增→PCR產(chǎn)物純化→PCR產(chǎn)物測序→BSP測序結(jié)果可視化分析將從人 HMLE (immortalized human mammary epithelial cells,永生化乳腺上皮細(xì)胞)細(xì)胞中抽提的染色體DNA在上、下游引物的5’端酶切位點分別插入NheI和XhoI限制性內(nèi)切酶。結(jié)果片段克隆到pGL3熒光素酶標(biāo)記低拷貝非病毒克隆載體載體并測序。采用PCR技術(shù)擴(kuò)增CD44啟動子。將細(xì)菌質(zhì)粒在LB培養(yǎng)基過夜培養(yǎng)后使用小提質(zhì)粒試劑盒提取質(zhì)粒DNA,并采用瓊脂糖凝膠電泳檢測其活性以及條帶位置。根據(jù)其引入的雙限制性內(nèi)切酶識別位點使用限制性內(nèi)切酶NheI和XhoI進(jìn)行雙酶切并采用瓊脂糖凝膠電泳檢測目的基因條帶位置。將酶切得到的目的基因通過瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行回收純化,并使用3’末端生物素標(biāo)記試劑盒標(biāo)記回收得到的質(zhì)粒DNA,并檢測驗證標(biāo)記效率。將凍存的colo-320(人結(jié)腸腺癌細(xì)胞)大量培養(yǎng)后加入CD44抗體進(jìn)行流式細(xì)胞分選術(shù),檢測陽性率:提取核蛋白。將回收并標(biāo)記的質(zhì)粒DNA與提取的核蛋白進(jìn)行電泳凝膠遷移率改變實驗(EMSA)4,檢測質(zhì)粒DNA與核蛋白結(jié)合情況。并將目的條帶質(zhì)譜測序分析蛋白質(zhì)成分。結(jié)果:1.BSP測序結(jié)果可視化分析得出:4個樣品在CD44基因外顯子1(含外顯子1)上游大概2000bp序列上未發(fā)生甲基化,沒有甲基化的位點。2.自質(zhì)粒載體CD44promoter pGL3中提取的CD44啟動子質(zhì)粒DNA與目的條帶一致,位于4148bp。3.使用限制性內(nèi)切酶Nh e I、X h o I雙酶切CD44啟動子質(zhì)粒DNA與目的條帶一致,位于2000bp。4.回收得到雙酶切后的CD44啟動子質(zhì)粒DNA與目的條帶一致,位于2000bp。5.3’末端生物素成功標(biāo)記回收得到的CD44啟動子質(zhì)粒DNA。6.EMSA電泳顯示CD44啟動子質(zhì)粒DNA與colo-320CD44+細(xì)胞核蛋白結(jié)合的反應(yīng)組較其他兩組移動的慢,表明CD44啟動子質(zhì)粒與colo-320CD44+細(xì)胞核蛋白成功結(jié)合。7.質(zhì)譜分析得出:蛋白得分21分,成功鑒定,可靠性達(dá)到顯著水平。測序結(jié)果證實,在核蛋白中至少有30個蛋白參與了轉(zhuǎn)錄,經(jīng)綜合分析,較重要的有Serum albumin(血清白蛋白)、I3L1U9 HUMAN(肌動蛋白,n斷)、POTE ankyrin domain family member(POTE錨蛋白、Keratin, type I cytoskeletal 10(角蛋白,1型上皮細(xì)胞)、K22E HUMAN(角蛋白,2型上皮細(xì)胞骨架)。結(jié)論:1.結(jié)直腸癌中CD44異常表達(dá)不是通過啟動子甲基化調(diào)控的。2.結(jié)直腸癌CD44異常表達(dá)是通過CD44啟動子結(jié)合相關(guān)蛋白調(diào)控的。3.白蛋白-組蛋白復(fù)合體可激活CD44基因轉(zhuǎn)錄,導(dǎo)致結(jié)直腸癌中CD44異常表達(dá);錨蛋白與CD44啟動子結(jié)合相互作用,是促進(jìn)結(jié)直腸癌CD44異常表達(dá)的重要因素;肌動蛋白和角蛋白與CD44相互作用促進(jìn)結(jié)直腸癌增殖、浸潤和轉(zhuǎn)移。4.結(jié)直腸癌CD44表達(dá)調(diào)控有待深入研究,對臨床有重要意義。
【關(guān)鍵詞】:CD44啟動子 DNA結(jié)合蛋白 結(jié)直腸癌 電泳遷移率改變分析
【學(xué)位授予單位】:大連醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】:碩士
【學(xué)位授予年份】:2015
【分類號】:R735.34
【目錄】:
  • 中文摘要7-9
  • 英文摘要9-12
  • 前言12-14
  • 材料和方法14-31
  • 2.1 探針制備14-19
  • 2.2 探針標(biāo)記19-21
  • 2.3 探針標(biāo)記靈敏度檢測21-22
  • 2.4 細(xì)胞培養(yǎng)22-24
  • 2.5 核蛋白提取24-25
  • 2.6 CD44啟動子甲基化驗證25-27
  • 2.7 EMSA電泳遷移率實驗27-29
  • 2.8 鹽橋法轉(zhuǎn)膜29-31
  • 2.9 EMSA凝膠質(zhì)譜測序由蛋白質(zhì)中心完成31
  • 結(jié)果31-60
  • 3.1 細(xì)菌培養(yǎng)及質(zhì)粒擴(kuò)X,

    本文編號:844953

資料下載
論文發(fā)表

本文鏈接:http://sikaile.net/yixuelunwen/zlx/844953.html


Copyright(c)文論論文網(wǎng)All Rights Reserved | 網(wǎng)站地圖 |

版權(quán)申明:資料由用戶3ec21***提供,本站僅收錄摘要或目錄,作者需要刪除請E-mail郵箱bigeng88@qq.com
亚洲国产四季欧美一区| 亚洲中文字幕剧情在线播放| 一区二区三区国产日韩| 欧美色欧美亚洲日在线| 内射精子视频欧美一区二区| 国产又长又粗又爽免费视频| 在线免费观看黄色美女| 熟女乱一区二区三区四区| 男生和女生哪个更好色| 亚洲熟妇熟女久久精品| 欧洲日本亚洲一区二区| 日韩和欧美的一区二区三区 | 我要看日本黄色小视频| 国产精品一区二区不卡中文| 在线日本不卡一区二区| 99热在线播放免费观看| 一区二区三区日韩中文| 不卡中文字幕在线免费看| 欧美日韩一级aa大片| 粉嫩国产美女国产av| 日本不卡在线视频中文国产| 亚洲男人的天堂就去爱| 日韩女优精品一区二区三区| 99精品人妻少妇一区二区人人妻| 91亚洲国产成人久久精品麻豆| 樱井知香黑人一区二区| 国产亚洲精品俞拍视频福利区| 久久国内午夜福利直播| 亚洲国产精品无遮挡羞羞| 在线观看免费午夜福利| 国产欧美日韩精品一区二| 国内外免费在线激情视频| 欧美尤物在线视频91| 日本福利写真在线观看| 亚洲中文字幕在线乱码av| 亚洲国产av精品一区二区| 中文字幕日韩欧美理伦片| 日本一本在线免费福利| 欧美日韩精品视频在线| 国产成人免费激情视频| 激情五月天免费在线观看|