本文關(guān)鍵詞：CD44啟動子對結(jié)直腸癌CD44陽性表達(dá)調(diào)控機(jī)制的研究

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【摘要】：目的：CD44異常表達(dá)是結(jié)直腸癌形成及發(fā)展的重要因素。CD44作為細(xì)胞黏附分子,在結(jié)直腸癌中表達(dá),可介導(dǎo)及參與腫瘤的生成及轉(zhuǎn)移。鑒于CD44表達(dá)在結(jié)直腸癌發(fā)生、發(fā)展過程中的重要作用,研究結(jié)直腸癌中CD44的表達(dá)調(diào)控機(jī)制對揭示結(jié)直腸癌的發(fā)生發(fā)展機(jī)理及防治腫瘤復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移有著重要意義。但目前對結(jié)直腸癌CD44異常表達(dá)調(diào)控的研究報道甚少。本研究通過檢測分析CD44啟動子DNA結(jié)合蛋白對結(jié)直腸癌CD44表達(dá)的調(diào)控作用,探討CD44啟動子與結(jié)合蛋白的相關(guān)作用,并尋找在其中發(fā)揮調(diào)控作用的蛋白或蛋白群,從而在轉(zhuǎn)錄水平查證CD44啟動子結(jié)合蛋白對CD44表達(dá)的激活和調(diào)控作用以及對結(jié)直腸癌生物學(xué)行為的影響,為揭示結(jié)直腸癌的發(fā)生發(fā)展機(jī)理及復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的防治奠定基礎(chǔ),也為結(jié)直腸癌的基因治療提供實驗依據(jù)以及潛在的治療靶點。方法：CD44啟動子甲基化驗證：分別從陰性和陽性淋巴細(xì)胞和LOVO(人結(jié)腸癌細(xì)胞)細(xì)胞中提取基因組DNA提取→亞硫酸氫鹽處理→BSP引物設(shè)計合成→PCR擴(kuò)增→PCR產(chǎn)物純化→PCR產(chǎn)物測序→BSP測序結(jié)果可視化分析將從人 HMLE (immortalized human mammary epithelial cells,永生化乳腺上皮細(xì)胞)細(xì)胞中抽提的染色體DNA在上、下游引物的5’端酶切位點分別插入NheI和XhoI限制性內(nèi)切酶。結(jié)果片段克隆到pGL3熒光素酶標(biāo)記低拷貝非病毒克隆載體載體并測序。采用PCR技術(shù)擴(kuò)增CD44啟動子。將細(xì)菌質(zhì)粒在LB培養(yǎng)基過夜培養(yǎng)后使用小提質(zhì)粒試劑盒提取質(zhì)粒DNA,并采用瓊脂糖凝膠電泳檢測其活性以及條帶位置。根據(jù)其引入的雙限制性內(nèi)切酶識別位點使用限制性內(nèi)切酶NheI和XhoI進(jìn)行雙酶切并采用瓊脂糖凝膠電泳檢測目的基因條帶位置。將酶切得到的目的基因通過瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行回收純化,并使用3’末端生物素標(biāo)記試劑盒標(biāo)記回收得到的質(zhì)粒DNA,并檢測驗證標(biāo)記效率。將凍存的colo-320(人結(jié)腸腺癌細(xì)胞)大量培養(yǎng)后加入CD44抗體進(jìn)行流式細(xì)胞分選術(shù),檢測陽性率：提取核蛋白。將回收并標(biāo)記的質(zhì)粒DNA與提取的核蛋白進(jìn)行電泳凝膠遷移率改變實驗(EMSA)4,檢測質(zhì)粒DNA與核蛋白結(jié)合情況。并將目的條帶質(zhì)譜測序分析蛋白質(zhì)成分。結(jié)果：1.BSP測序結(jié)果可視化分析得出：4個樣品在CD44基因外顯子1(含外顯子1)上游大概2000bp序列上未發(fā)生甲基化,沒有甲基化的位點。2.自質(zhì)粒載體CD44promoter pGL3中提取的CD44啟動子質(zhì)粒DNA與目的條帶一致,位于4148bp。3.使用限制性內(nèi)切酶Nh e I、X h o I雙酶切CD44啟動子質(zhì)粒DNA與目的條帶一致,位于2000bp。4.回收得到雙酶切后的CD44啟動子質(zhì)粒DNA與目的條帶一致,位于2000bp。5.3’末端生物素成功標(biāo)記回收得到的CD44啟動子質(zhì)粒DNA。6.EMSA電泳顯示CD44啟動子質(zhì)粒DNA與colo-320CD44+細(xì)胞核蛋白結(jié)合的反應(yīng)組較其他兩組移動的慢,表明CD44啟動子質(zhì)粒與colo-320CD44+細(xì)胞核蛋白成功結(jié)合。7.質(zhì)譜分析得出：蛋白得分21分,成功鑒定,可靠性達(dá)到顯著水平。測序結(jié)果證實,在核蛋白中至少有30個蛋白參與了轉(zhuǎn)錄,經(jīng)綜合分析,較重要的有Serum albumin(血清白蛋白)、I3L1U9 HUMAN(肌動蛋白,n斷)、POTE ankyrin domain family member(POTE錨蛋白、Keratin, type I cytoskeletal 10(角蛋白,1型上皮細(xì)胞)、K22E HUMAN(角蛋白,2型上皮細(xì)胞骨架)。結(jié)論：1.結(jié)直腸癌中CD44異常表達(dá)不是通過啟動子甲基化調(diào)控的。2.結(jié)直腸癌CD44異常表達(dá)是通過CD44啟動子結(jié)合相關(guān)蛋白調(diào)控的。3.白蛋白-組蛋白復(fù)合體可激活CD44基因轉(zhuǎn)錄,導(dǎo)致結(jié)直腸癌中CD44異常表達(dá)；錨蛋白與CD44啟動子結(jié)合相互作用,是促進(jìn)結(jié)直腸癌CD44異常表達(dá)的重要因素；肌動蛋白和角蛋白與CD44相互作用促進(jìn)結(jié)直腸癌增殖、浸潤和轉(zhuǎn)移。4.結(jié)直腸癌CD44表達(dá)調(diào)控有待深入研究,對臨床有重要意義。
【關(guān)鍵詞】：CD44啟動子 DNA結(jié)合蛋白 結(jié)直腸癌 電泳遷移率改變分析
【學(xué)位授予單位】：大連醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R735.34
【目錄】：

• 中文摘要7-9
• 英文摘要9-12
• 前言12-14
• 材料和方法14-31
• 2.1 探針制備14-19
• 2.2 探針標(biāo)記19-21
• 2.3 探針標(biāo)記靈敏度檢測21-22
• 2.4 細(xì)胞培養(yǎng)22-24
• 2.5 核蛋白提取24-25
• 2.6 CD44啟動子甲基化驗證25-27
• 2.7 EMSA電泳遷移率實驗27-29
• 2.8 鹽橋法轉(zhuǎn)膜29-31
• 2.9 EMSA凝膠質(zhì)譜測序由蛋白質(zhì)中心完成31
• 結(jié)果31-60
• 3.1 細(xì)菌培養(yǎng)及質(zhì)粒擴(kuò)X，
  
  本文編號：844953
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