本文關(guān)鍵詞：抑制KLF8的表達(dá)誘導(dǎo)細(xì)胞分化并提高結(jié)直腸癌對5-FU的敏感性

  更多相關(guān)文章： KLF8 ERK1/2 F-actin siRNA 慢病毒 結(jié)直腸癌

【摘要】：研究背景和目的KLF8是KLF轉(zhuǎn)錄因子家族中的一員,在腫瘤的發(fā)生中扮演著重要的角色。它在羧基端含有高度保守的鋅指結(jié)構(gòu)結(jié)合域,并與目標(biāo)基因啟動子CACCC區(qū)域結(jié)合。KLF8最初是作為p球蛋白基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄抑制因子而被認(rèn)識,隨后人們發(fā)現(xiàn)它在細(xì)胞增殖、腫瘤轉(zhuǎn)化、上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)變、腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移的調(diào)節(jié)中起著重要作用。由此推斷,KLF8應(yīng)該在眾多組織中表達(dá),但是實(shí)際情況是它在絕大多數(shù)正常細(xì)胞和組織中無法檢測到,卻在人類多種腫瘤中呈現(xiàn)過表達(dá),包括乳腺癌、卵巢癌、腎癌、肝癌、胃癌和腦部腫瘤。因此,KLF8已經(jīng)成為一個重要的腫瘤調(diào)節(jié)蛋白。然而,KLF8在結(jié)直腸癌中的表達(dá)和作用卻未見報道。本研究擬通過檢測KLF8在結(jié)直腸癌中的表達(dá),進(jìn)一步明確其在細(xì)胞分化中的作用,并探討KLF8沉默表達(dá)對惡性腫瘤細(xì)胞增殖的抑制作用。材料和方法1.化學(xué)藥品,組織標(biāo)本和細(xì)胞系丁酸鈉(NaB)和5-FU從Sigma(St. Louis, MO)購得,羅丹明毒蕈肽從Molecular Probes (Eugene, OR)購得。山羊抗人KLF8和GAPDH抗體從Aviva Systems Biology公司(San Diego, CA)購得。對于蛋白免疫印跡分析,14對結(jié)腸癌和鄰近正常組織(腫瘤邊緣5厘米)來自南方醫(yī)院(廣州,中國)外科手術(shù)切除的患者。所述組織標(biāo)本一部分取下后迅速冷凍于液氮中,然后儲存在-70-C冰箱直到使用時拿出。另一部分組織包埋于石蠟中,切片,然后用免疫組織化學(xué)進(jìn)行的組織病理學(xué)檢測,組織中陽性染色的癌細(xì)胞10%即視為陽性。結(jié)直腸癌細(xì)胞系(HCT1116, HT29, Lovo, SW620, SW480)和人胚腎293(HEK293)細(xì)胞系從ATCC (Rockville, MD)中獲得,并在RPMI1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)如先前所述。2.RNA分離和逆轉(zhuǎn)錄PCR分析使用TRI試劑(Sigma)分離總RNA[7],然后根據(jù)制造商的說明書使用SuperScript Ⅱ(Invitrogen, Carlsbad, CA)轉(zhuǎn)錄。引物的序列如下：癌胚抗原(CEA)上游引物：5'-AACCCTTCATCACCAGCAAC-3',CEA下游引物：5'-CAGGAGAGGCTGAGGTTCAC-3';E-cadherin上游引物： 5’-TGCCCAGAAAATGAAAAAGG-3',E-cadherin下游引物： 5’-GTGTATGTGGCAATGCGTTC-3';GAPDH上游引物： 5’-GTCAACGGATTTGGTCGTATTG-3',GAPDH下游引物： 5’-CTCCTGGAAGATGGTGATGGG-3'。CEA,E鈣粘蛋白和GAPDH的PCR產(chǎn)物的預(yù)期片段大小分別為340,200和204bp。3.蛋白免疫印跡分析抽提細(xì)胞總蛋白裂解產(chǎn)物用于蛋白免疫印跡分析。印跡通過一抗與辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗結(jié)合進(jìn)行探測�？乖�-抗體復(fù)合物通過使用增強(qiáng)的化學(xué)發(fā)光系統(tǒng)(Amersham Biosciences, UK)使其可視化。4.細(xì)胞錨定依賴性和錨定非依賴性生長檢測陰性對照siRNA (src siRNA)和轉(zhuǎn)染KLF8 siRNA的細(xì)胞一式三份接種在含有0.7%瓊脂基質(zhì)和0.35%瓊脂上膠的平板[刀。菌落用考馬斯藍(lán)染色評分,含有至少50個細(xì)胞的克隆被認(rèn)為是可行的。細(xì)胞增殖試劑WST-1,一個即用型比色測定法(Roche Diagnostics),也被使用。5.細(xì)胞凋亡檢測根據(jù)產(chǎn)品使用說明(Trevigen Inc., Gaithersburg, MD)在細(xì)胞使用膜聯(lián)蛋白V-FITC試劑盒,,通過流式細(xì)胞術(shù)使用Winmdi2.9流式分析軟件進(jìn)行凋亡檢測[18]。我們也通過用Hoechst33258對細(xì)胞核進(jìn)行染色,然后在熒光顯微鏡下觀察進(jìn)行凋亡檢測。凋亡蛋白酶3、8、9的活性按照產(chǎn)品說明書(Clontech, Mountain View,CA)使用ApoAlert凋亡蛋白酶比色測定試劑盒來進(jìn)行檢測。6.免疫熒光纖維肌動蛋白染色，將細(xì)胞固定于蓋玻片上并用若丹明共軛毒蕈肽(5 U/ml,Molecular Probes)在PBS中室溫孵育。此外,細(xì)胞核用1μg/ml的Hoechst33258進(jìn)行染色。最后洗滌、固定蓋玻片,并使用Zeiss Axioskop熒光顯微鏡觀察。7.體外轉(zhuǎn)染siRNA本實(shí)驗(yàn)siRNA雙鏈包含有21堿基對并有2個堿基脫氧核苷酸突出端(Proligo, Singapore)。在KLF8 siRNA (NM_007250,正義鏈：CGAUAUGGAUAAACUCAUATT)序列與先前的研究是一樣的[19],src siRNA (5'-TTCTCCGAACGTGTCACGT-3'),不針對任何基因,被用作陰性對照。細(xì)胞siRNA雙鏈體的轉(zhuǎn)染用脂質(zhì)體按照(Invitrogen)產(chǎn)品說明書來進(jìn)行。8.構(gòu)建和轉(zhuǎn)染包含KLF8短發(fā)夾RNA的慢病毒載體為了進(jìn)一步研究siRNA誘導(dǎo)下調(diào)KLF8在活體腫瘤生長中的作用,我們構(gòu)建了KLF8-RNA干擾慢病毒載體(pGCSIL-KLF8shRNA)(上海吉凱基因技術(shù)有限公司),綠色熒光蛋白慢病毒載體(pGCSIL-GFP)用作陰性對照。雙鏈寡核苷酸編碼人KLF8-vshRNA (CCGGCTAGCATGCTACAAGCTCCA-ATTCAAGAGATTGGAGCTTGTAGCATGCTAGTTTTTG)被插入到短發(fā)夾RNA (shRNA)表達(dá)載體pGCSIL (Shanghai GeneChem Co, Ltd),克隆的身份通過測序進(jìn)行驗(yàn)證。重組慢病毒載體通過共轉(zhuǎn)染試驗(yàn)實(shí)現(xiàn),即將慢病毒表達(dá)載體以及慢病毒包裝質(zhì)�；旌衔镉肔ipofectamineTM 2000按照產(chǎn)品說明書共轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞。傳染性的慢病毒顆粒在轉(zhuǎn)染后48小時收集,然后通過0.45-μm乙酸纖維素濾器過濾。病毒濃縮和滴度通過在293T細(xì)胞中連續(xù)稀釋確定。對于慢病毒轉(zhuǎn)染,將Lovo細(xì)胞按照1×105個細(xì)胞/孔在6孔培養(yǎng)板進(jìn)行傳代培養(yǎng),然后按照感染倍數(shù)(MOI)為50轉(zhuǎn)染表達(dá)KLF8-siRNA或src-siRNA的慢病毒,在轉(zhuǎn)染后72小時收獲細(xì)胞,轉(zhuǎn)染效率通過計(jì)數(shù)綠色熒光蛋白陽性細(xì)胞的百分比進(jìn)行評估。9.異位移植瘤模型轉(zhuǎn)染KLF8的抗腫瘤作用通過活體裸鼠異種移植模型進(jìn)行評估。五到六周齡雌性BALB/c裸鼠在南方醫(yī)科大學(xué)(中國廣州)無菌飼養(yǎng)環(huán)境下飼養(yǎng),所有動物研究均經(jīng)過南方醫(yī)科大學(xué)動物倫理委員會批準(zhǔn)實(shí)施。感染src shRNA和KLF8shRNA'慢病毒的Lovo細(xì)胞在指數(shù)生長期收獲,然后用無菌PBS將細(xì)胞進(jìn)行兩次洗滌,并以每毫升5x 107個細(xì)胞的密度重新懸浮于PBS中。接下來將細(xì)胞懸浮液(0.1 ml；5 x 106個細(xì)胞)注射到每只裸鼠的右背皮下。將感染src-shRNA慢病毒的Lovo細(xì)胞分別注射到a組和c組裸鼠。將感染KLF8-shRNA慢病毒的Lovo細(xì)胞分別注射到b組和d組裸鼠。皮下注射Lovo細(xì)胞十四天后,將5-FU用10-ml的微型注射器(Hamilton, Reno, NV, USA)通過腹腔內(nèi)注射注入c組和d組,注射劑量為50μg/kg/次,每兩天一次,共12次。每組5只裸鼠,腫瘤體積計(jì)算如下：V=(4/3)R12R2,其中R1代表短徑1,R2代表長徑2,并且R1R2。最后在第42天將小鼠處死,切下腫瘤,快速冷凍在液氮中并儲存在-70-C冰箱,為行蛋白免疫印跡檢測準(zhǔn)備。統(tǒng)計(jì)分析采用SPSS13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。體內(nèi)及體外實(shí)驗(yàn)檢測數(shù)據(jù)均采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±SD)表示,如果統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)方差齊性,我們采用兩組間獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)或多組間one way ANOVA進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。如果方差不齊,我們則使用Satterthwaite近似t檢驗(yàn)或Dunnett's T3檢驗(yàn),P0.05為差異有顯著性。結(jié)果1.結(jié)腸癌組織中KLF8蛋白表達(dá)水平高于正常組織我們首先發(fā)現(xiàn)在與人上皮細(xì)胞系HEK293細(xì)胞相比,五個癌癥細(xì)胞系HCT1116、HT29、Lovo、SW620和SW480中KLF8蛋白表達(dá)顯著增高(圖1)。然后,我們通過蛋白免疫印跡檢測了KLF8在正常組織(N)和對應(yīng)的結(jié)腸癌組織(T)中的表達(dá)。在14對組織中,有10對癌組織的KLF8表達(dá)水平高于正常組織(圖2)。我們還將從腸鏡下采集的癌癥和正常組織標(biāo)本通過免疫組化方法來檢測KLF8的表達(dá)。我們發(fā)現(xiàn)在所有收集的癌組織中KLF8蛋白特定表達(dá)在細(xì)胞核,但不表達(dá)在對照正常組織中,如圖3(b)和(c)所示。圖3顯示KLF8在正常組織和癌組織標(biāo)本中的表達(dá)。以上表明,KLF8在結(jié)直腸癌中是高表達(dá)的。2.ERK1／2組成性活化的抑制下調(diào)KLF8表達(dá)先前的研究已經(jīng)表明,活化的MAPK/ERK信號通路參與結(jié)直腸癌[2,21]細(xì)胞增殖的調(diào)節(jié)。因此,我們通過加入一個特定的MEK/ERK信號通路活化抑制劑-U0126,在Lovo和SW620細(xì)胞孵育48小時后,觀察分析了抑制ERK信號通路對KLF8表達(dá)的影響。我們發(fā)現(xiàn),磷酸化ERK1/2和KLF8的表達(dá)在經(jīng)過U0126處理后都以劑量和時間依賴性的方式顯著下調(diào)(圖4和圖5)。另一方面,我們觀察到敲低表達(dá)KLF8對ERK活化的影響。免疫印跡方法驗(yàn)證siRNA敲低表達(dá)效率后,發(fā)現(xiàn)磷酸化ERK1/2的表達(dá)在KLF8敲低表達(dá)后顯著降低。然而,ERK1/2的表達(dá)沒有變化(圖6)。這些結(jié)果表明,在結(jié)直腸癌中抑制KLF8表達(dá)可能在ERK活化中起重要作用。3.腸癌細(xì)胞中壓低KLF8表達(dá)誘導(dǎo)細(xì)胞分化為明確KLF8對細(xì)胞分化的作用,我們首先研究了促分化劑對KLF8表達(dá)圈的影響。丁酸鈉作用于Lovo和SW620細(xì)胞,顯著降低KLF8(圖7)的表達(dá)。接下來,我們通過RT-PCR發(fā)現(xiàn)敲低KLF8表達(dá)顯著增加分化標(biāo)志CEA和E-cadherin23](圖8)的表達(dá)。此外,使用鬼筆環(huán)肽染色觀察細(xì)胞形態(tài),以檢測微絲肌動蛋白的定位,轉(zhuǎn)染KLF8-siRNA的微絲肌動蛋白細(xì)胞質(zhì)呈彌漫和大致均勻分布表現(xiàn)。然而,轉(zhuǎn)染src-siRNA的人結(jié)腸癌細(xì)胞系表現(xiàn)明顯聚集體,并在該凸部的邊緣區(qū)域中有多個肌動蛋白聚合團(tuán)塊(圖9)。因此,上述結(jié)果表明敲低KLF8表達(dá)可能誘導(dǎo)結(jié)直腸癌細(xì)胞的分化。4.敲低KLF8表達(dá)抑制細(xì)胞錨定依賴性和錨定非依賴性生長我們使用WST-1測定法評估了壓低KLF8表達(dá)對結(jié)直腸癌細(xì)胞生長特性的影響。我們發(fā)現(xiàn),轉(zhuǎn)染KLF8 siRNA的Lovo細(xì)胞在培養(yǎng)24、48和72小時后的生長速率分別為0.6±0.05%,1.22±0.01%和1.72±0.09%,而那些轉(zhuǎn)染src siRNA的Lovo細(xì)胞生長速率分別為1±0.05%,1.74±0.07%和2.97±0.05%(圖10)。我們發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染了KLF8 siRNA和src siRNA的Lovo細(xì)胞在所有3個時間點(diǎn)生長諫率之間有顯著差異(P0.05), SW620細(xì)胞中也可以觀察到類似的結(jié)果(圖10)。錨定非依賴性生長是腫瘤惡變的一個關(guān)鍵特征。因此,為確定KLF8的功能我們進(jìn)行了軟瓊脂實(shí)驗(yàn)。正如預(yù)期的那樣,壓低KLF8表達(dá)14天后Lovo和SW620細(xì)胞的菌落形成能力得到顯著抑制(圖11)。因此,敲低KLF8表達(dá)抑制了結(jié)直腸癌細(xì)胞的錨定依賴性和錨定非依賴性生長。5.抑制KLF8表達(dá)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡并提高癌細(xì)胞對化療藥物5-FU的敏感性為了研究敲低KLF8表達(dá)誘導(dǎo)癌細(xì)胞生長抑制的機(jī)制,我們使用Annexin V-FITC和PI雙染細(xì)胞,隨后用流式細(xì)胞儀分析,進(jìn)行細(xì)胞凋亡檢測。如圖12所示,Lovo細(xì)胞中凋亡細(xì)胞的百分比從轉(zhuǎn)染src-siRNA后的0.81%顯著增加到轉(zhuǎn)染KLF8 siRNA后的32.58%,和類似的結(jié)果也可見于SW620細(xì)胞(從5.71%至24.2%)。使用Hoechst 33258染色使細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)在個體細(xì)胞水平得到進(jìn)一步證實(shí)。我們發(fā)現(xiàn),與轉(zhuǎn)染src-siRNA的Lovo細(xì)胞(5±1%,P0.05)相比,細(xì)胞核濃縮呈陽性的比例在轉(zhuǎn)染KLF8-siRNA的Lovo細(xì)胞(30±2%)中更高(圖13)。類似的結(jié)果也見于SW620細(xì)胞。凋亡蛋白酶3,8和9的活性在轉(zhuǎn)染KLF8 siRNA后得到分析,并且標(biāo)準(zhǔn)化為光密度,其測定在405nm。如圖14所示,凋亡蛋白酶3,8和9的活性在轉(zhuǎn)染KLF8 siRNA的細(xì)胞中與轉(zhuǎn)染src siRNA的細(xì)胞相比顯著增高(圖14,P0.05)。為了評估KLF8 siRNA在化療誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡中的作用,我們通過流式細(xì)胞術(shù)分析了轉(zhuǎn)染KLF8 siRNA或src siRNA的細(xì)胞分別用或不用5-FU[50μg/m1溶于生理鹽水(NS)]處理后的凋亡變化。如圖15所示,相對于轉(zhuǎn)染src siRNA的對照組細(xì)胞, 轉(zhuǎn)染KLF8 siRNA并5-FU處理組細(xì)胞凋亡指數(shù)顯著增加。此外,我們使用赫斯特33258染色對凋亡細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變進(jìn)行了分析。與src siRNA+5-FU對照組細(xì)胞(P0.05)相比,KLF8 siRNA+5-FU組Lovo細(xì)胞核濃縮呈陽性的比例增高(圖16)。類似的結(jié)果見于SW620細(xì)胞。結(jié)果表明,KLF8 siRNA增強(qiáng)癌細(xì)胞對5-FU誘導(dǎo)凋亡觸發(fā)的敏感性。6.抑制KLF8表達(dá)可提高體內(nèi)癌細(xì)胞對5-FU誘導(dǎo)凋亡的敏感性為確定KLF8沉默是否能抑制體內(nèi)腫瘤的發(fā)展,我們將轉(zhuǎn)染慢病毒的Lovo細(xì)胞注射到裸鼠的右背側(cè)皮下,同時裸鼠也分為5-FU處理組和非5-FU處理組(圖17)。如圖18所示,注射轉(zhuǎn)染Lenti-KLF8-shRNA Lovo細(xì)胞的裸鼠腫瘤體積相比注射轉(zhuǎn)染lenti-src-shRNA Lovo細(xì)胞的裸鼠明顯變小(a組和b組)。類似的結(jié)果也可在5-FU處理組與非5-FU處理組裸鼠進(jìn)行比較中發(fā)現(xiàn)(c組和d組)。更重要的是,將小鼠同時注射轉(zhuǎn)染Lenti-KLF8-shRNA Lovo細(xì)胞和5-FU的裸鼠呈現(xiàn)的腫瘤結(jié)節(jié)最小。在圖19,我們通過蛋白免疫印跡檢測了KLF8在四個裸鼠組腫瘤組織中的表達(dá)。顯然,在同時注射了轉(zhuǎn)染Lenti-KLF8-shRNA的Lovo細(xì)胞和5-FU的裸鼠腫瘤組織中,KLF8的表達(dá)是最低的。因此,在體內(nèi)Lenti-KLF8-shRNA與5-FU之間存在協(xié)同效應(yīng),共同抑制了Lovo細(xì)胞增殖。綜上所述,這些數(shù)據(jù)表明,用Lenti-KLF8-shRNA靶向作用于KLF8對體內(nèi)腫瘤發(fā)生有抑制作用。此外, KLF8的抑制與5-FU之間在結(jié)直腸癌的治療中存在協(xié)同效應(yīng)。結(jié)論1.免疫蛋白印記和免疫組化實(shí)驗(yàn)證實(shí)轉(zhuǎn)錄因子KLF8在腸癌細(xì)胞系和腸癌組織中是高表達(dá)的。2.蛋白免疫印跡實(shí)驗(yàn)證實(shí)腸癌細(xì)胞中ERK1／2組成性活化的抑制下調(diào)KLF8表達(dá),壓低KLF8表達(dá)可阻滯ERK信號通路的活化。3. RT-PCR在RNA水平證實(shí)壓低KLF8表達(dá)顯著增加分化標(biāo)志CEA和E-cadherin的表達(dá),同樣細(xì)胞形態(tài)學(xué)方面也證實(shí)敲低KLF8表達(dá)可能誘導(dǎo)結(jié)直腸癌細(xì)胞的分化。4.WST-1檢測和軟瓊脂克隆形成實(shí)驗(yàn)均證實(shí)壓低KLF8表達(dá)可明顯抑制腸癌細(xì)胞增殖能力,抑制細(xì)胞錨定依賴性和錨定非依賴性生長。5.通過流式細(xì)胞分析和免疫熒光染色實(shí)驗(yàn)證實(shí)壓低KLF8表達(dá)可明顯誘導(dǎo)腸癌細(xì)胞凋亡并顯著增加腸癌細(xì)胞對5-FU的敏感性。6.通過裸鼠異種移植成瘤實(shí)驗(yàn),證實(shí)壓低KLF8表達(dá)可明顯抑制體內(nèi)腫瘤增殖,并且Lenti-KLF8-shRNA與5-FU之間存在協(xié)同效應(yīng),有望為結(jié)腸癌治療提供新的靶點(diǎn)。
【關(guān)鍵詞】：KLF8 ERK1/2 F-actin siRNA 慢病毒 結(jié)直腸癌
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R735.34
【目錄】：

• 摘要3-11
• ABSTRACT11-23
• 前言23-29
• 一、實(shí)驗(yàn)材料29-36
• 二、實(shí)驗(yàn)方法36-50
• 三、結(jié)果50-67
• 1、結(jié)腸癌組織中KLF8蛋白表達(dá)水平高于正常組織50-52
• 2、ERK1/2組成性活化的抑制下調(diào)KLF8表達(dá)52-54
• 3、腸癌細(xì)胞中壓低KLF8表達(dá)誘導(dǎo)細(xì)胞分化54-56
• 4、敲低KLF8表達(dá)抑制細(xì)胞錨定依賴性和錨定非依賴性生長56-59
• 5、抑制KLF8表達(dá)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡并提高癌細(xì)胞對化療藥物5-氟尿嘧啶的敏感性59-63
• 6、抑制KLF8表達(dá)可提高體內(nèi)癌細(xì)胞對5-氟尿嘧啶誘導(dǎo)凋亡的敏感性63-67
• 四、討論67-71
• 全文小結(jié)71-73
• 參考文獻(xiàn)73-80
• 中英文縮略詞對照表80-82
• 攻讀學(xué)位期間論文撰寫情況82-83
• 致謝83-84

【參考文獻(xiàn)】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前2條

1 劉元寧;常亞萍;李妼;張浩;田明堯;;針對H1N1病毒的多特征siRNA設(shè)計(jì)[J];吉林大學(xué)學(xué)報(工學(xué)版);2010年03期

2 馮潔;湯正好;臧國慶;張榮貴;余永勝;;KLF6、Sp1蛋白在肝癌、肝硬化組織中的表達(dá)及意義[J];胃腸病學(xué)和肝病學(xué)雜志;2008年02期

，

本文編號：830785