本文關(guān)鍵詞：DKK1對(duì)非小細(xì)胞肺癌增殖和轉(zhuǎn)移影響的研究

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【摘要】：研究背景與目的作為全球常見的惡性腫瘤之一,肺癌的發(fā)病率和死亡率呈逐年上升趨勢(shì)。從病理組織類型上可以將肺癌分為非小細(xì)胞肺癌(Non-small cell lung cancer,NSCLC)和小細(xì)胞肺癌(Small cell lung cancer,SCLC),非小細(xì)胞肺癌又可以分為腺癌、鱗癌、大細(xì)胞癌等多種亞型,約80%的肺癌病例為NSCLC。NSCLC的高死亡率與其易發(fā)生轉(zhuǎn)移的特性密切相關(guān),其中超過一半的病例在確診時(shí)已經(jīng)發(fā)生了轉(zhuǎn)移。因此,深入探索NSCLC的增殖和轉(zhuǎn)移能力及其相關(guān)分子機(jī)制,對(duì)臨床早期診斷以及病情的監(jiān)控和治療等都具有積極的作用。隨著研究的深入,眾多影響肺癌發(fā)生和發(fā)展的因素成為關(guān)注的重點(diǎn),Dickkopf-1(DKK1)就是其中之一。在脊椎動(dòng)物中DKK基因家族包括DKKl、DKK2、DKK3及DKK4四個(gè)成員,都屬于外分泌型的糖蛋白,DKK1作為Wnt信號(hào)通路的拮抗分子,一直都受到廣泛的關(guān)注。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn),DKK1在不同腫瘤中的表達(dá)量及其生物學(xué)功能有很大差異:一方面能夠抑制結(jié)腸癌和絨毛膜癌細(xì)胞的侵襲和遷移能力;另一方面卻能夠促進(jìn)食管癌細(xì)胞的增殖和侵襲能力。已有研究證實(shí)DKK1在多種癌癥的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮重要的作用,但它在肺癌中的作用及其機(jī)制卻不甚明了。本課題旨在研究DKK1對(duì)肺癌細(xì)胞的增殖、侵襲和遷移能力的影響,繼而分析其作用機(jī)制,探討DKK1對(duì)肺癌診斷、預(yù)防及治療的價(jià)值。方法應(yīng)用Western-blot方法檢測(cè)H1299、A549、95C、801D四種NSCLC細(xì)胞系中DKK1蛋白的表達(dá)水平。使用DKK1 shRNA重組慢病毒載體感染H1299、95C細(xì)胞系,來建立DKK1低表達(dá)的細(xì)胞模型H1299-DKK1-KD、95C-DKK1-KD。以無意義序列重組慢病毒載體感染的H1299、95C細(xì)胞系作為陰性對(duì)照H1299-NC、95C-NC,正常H1299、95C細(xì)胞系作為空白對(duì)照。通過Western-blot檢測(cè)已構(gòu)建的細(xì)胞模型中DKK1的表達(dá),驗(yàn)證構(gòu)建效果。細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn),單克隆集落形成實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證DKK1對(duì)nsclc細(xì)胞增殖能力的影響。通過transwell實(shí)驗(yàn)觀察dkk1對(duì)nsclc細(xì)胞遷移和侵襲能力的影響。采用western-blot檢測(cè)構(gòu)建成功的細(xì)胞模型中增殖相關(guān)蛋白β-鏈蛋白(β-catenin)、細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶1/2(extracellularregulatedproteinkinases1/2,erk1/2)、p-erk1/2及emt相關(guān)蛋白snail等蛋白的表達(dá)水平,探討dkk1對(duì)nsclc細(xì)胞增殖、侵襲及遷移能力影響的分子機(jī)制。結(jié)果1.western-blot結(jié)果表明,dkk1蛋白在h1299、95c中表達(dá)水平較高,在a549、801d中表達(dá)較低。2.利用熒光顯微鏡觀察,經(jīng)重組慢病毒感染的h1299、95c細(xì)胞中g(shù)fp陽(yáng)性率大于85%,且western-blot結(jié)果顯示dkk1在兩種細(xì)胞中蛋白表達(dá)水平較空白對(duì)照組顯著下降。經(jīng)無義序列重組慢病毒載體感染的兩種細(xì)胞系中dkk1的表達(dá)量與空白對(duì)照相比無變化。證明已成功構(gòu)建了dkk1低表達(dá)的h1299-dkk1-kd、95c-dkk1-kd細(xì)胞模型及陰性對(duì)照h1299-nc、95c-nc細(xì)胞模型。3.利用高內(nèi)涵分析平臺(tái)研究下調(diào)dkk1表達(dá)對(duì)h1299細(xì)胞增殖能力的影響。h1299-dkk1-kd組相比較于h1299及h1299-nc組細(xì)胞增殖能力明顯減低。單克隆集落形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,h1299-dkk1-kd組集落數(shù)相對(duì)于h1299、h1299-nc兩組下降60%,接觸受到抑制。這些結(jié)果提示下調(diào)dkk1可顯著抑制h1299細(xì)胞的增殖能力。4.不鋪膠transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,h1299-dkk1-kd和95c-dkk1-kd組每視野過膜細(xì)胞數(shù)為45.00±8.72和104.67±6.02,遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于陰性對(duì)照組h1299-nc(148.00±13.75)、9c-nc(235.67±28.68)和空白對(duì)照組h1299(147.67±9.07)、95c(235.00±23.06),提示下調(diào)dkk1的表達(dá)水平可抑制nsclc細(xì)胞的遷移能力。鋪膠transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,h1299-dkk1-kd和95c-dkk1-kd組每視野過膜細(xì)胞數(shù)為46.33±11.50和71.33±6.81,低于空白對(duì)照組h1299(255.33±13.58)、95c(293.00±13.07)和陰性對(duì)照組h1299-nc(258.00±19.00)、9c-nc(302.67±23.16),結(jié)果提示下調(diào)dkk1的表達(dá)水平能夠抑制nsclc細(xì)胞的侵襲能力。5.Western-blot結(jié)果顯示,磷酸化的Erk1/2蛋白在H1299-DKK1-KD組中的表達(dá)水平明顯低于對(duì)照組,H1299-DKK1-KD組中磷酸化的β-catenin表達(dá)水平較對(duì)照組明顯升高,提示DKK1對(duì)NSCLC細(xì)胞增殖能力的影響可能是通過活化Erk1/2、β-catenin來實(shí)現(xiàn)的。EMT相關(guān)蛋白snail在H1299-DKK1-KD的表達(dá)水平明顯低于對(duì)照組,提示DKK1對(duì)NSCLC細(xì)胞遷移及侵襲能力的影響可能是通過調(diào)控EMT相關(guān)蛋白snail來實(shí)現(xiàn)的。結(jié)論1.DKK1在四種NSCLC細(xì)胞系H1299、A549、95C和801D中的表達(dá)水平不同。2.DKK1可以促進(jìn)NSCLC細(xì)胞的增殖能力,這種作用可能是通過活化MAPK信號(hào)通路中的關(guān)鍵蛋白Erk1/2,或者Wnt信號(hào)通路中的下游作用元件β-catenin來實(shí)現(xiàn)的。3.DKK1可能通過調(diào)節(jié)EMT相關(guān)蛋白snail來影響NSCLC細(xì)胞的遷移、侵襲能力。
【關(guān)鍵詞】：DKK1 非小細(xì)胞肺癌 β-鏈蛋白
【學(xué)位授予單位】：北京市結(jié)核病胸部腫瘤研究所
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R734.2
【目錄】：

• 縮略詞表5-6
• 中文摘要6-9
• Abstract9-12
• 前言12-17
• 材料與方法17-29
• 實(shí)驗(yàn)結(jié)果29-40
• 討論40-46
• 結(jié)論46-47
• 參考文獻(xiàn)47-52
• 綜述一52-65
• 參考文獻(xiàn)60-65
• 綜述二65-74
• 參考文獻(xiàn)71-74
• 攻讀學(xué)位期間發(fā)表論文情況74-75
• 致謝75-76
• 個(gè)人簡(jiǎn)歷76-77

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