本文關鍵詞：欖香烯對肝細胞癌的抑制增殖作用和機制研究

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【摘要】：研究背景和目的原發(fā)性肝癌是世界上常見的惡性腫瘤中居第五位,常見的惡性腫瘤致死原因中居第三位。臨床資料研究分析提示肝細胞癌與肝內(nèi)膽管癌的生物特性以及預后有明顯不同,綜合性治療方案也有很大的區(qū)別。肝細胞癌占原發(fā)性肝癌比例90%以上,本研究主要針對肝細胞癌,因此對于下文中出現(xiàn)的肝癌均是肝細胞癌。肝炎病毒感染是肝癌發(fā)生的主要危險因素。雖然近年來乙肝疫苗的普遍接種以及父母對于疫苗接種的重視使新生兒感染HBV概率明顯降低,但是我國是乙肝病毒流行地區(qū),相關統(tǒng)計數(shù)據(jù)顯示,全國攜帶乙肝表面抗原人數(shù)約1億人,其中慢性乙型肝炎患者約為2000多萬人,由此可見我國仍然是肝炎大國,一部分慢性乙型肝炎病人會逐步發(fā)展至肝硬化,對于肝硬化的病人來說,約10-15%病人將發(fā)展至肝癌�，F(xiàn)在每年全世界新發(fā)病例約60余萬多例,僅我國有30余萬例,約占50%以上,肝癌的發(fā)生有年輕化的趨勢,這提示肝癌是嚴重危害我國人類健康的常見惡性腫瘤之一。肝炎-肝硬化-肝癌,常談的三步曲,70-80%左右的肝癌病人同時伴有肝硬化,這對于肝癌的治療無疑是雪上加霜。由于肝臟本身結(jié)構的特異性,接受雙重血供,經(jīng)門靜脈易出現(xiàn)肝內(nèi)播散,經(jīng)過淋巴管轉(zhuǎn)移或者血行轉(zhuǎn)移可轉(zhuǎn)移至肝外。肝癌的診斷主要依靠病史、血甲胎蛋白升高以及肝臟增強CT或者MRI影像學表現(xiàn),CT或者MRI提示腫瘤強化有“快進快出”的影像。肝癌病程進展較快,而肝癌又缺乏特異的臨床癥狀,使其早期診斷率低,確診時多已是中晚期,如不積極治療,自然病程較短。目前認為肝癌患者獲得長期生存的治療手段是手術,但是資料表明僅僅只有1/5的病人在就診時有手術的機會。肝癌患者接受根治性手術切除后,患者5年的生存率可達到85%左右。但是對于多數(shù)肝癌患者,由于就診時已是中晚期患者,失去手術的機會,化療、放療、生物治療以及中醫(yī)中藥治療等也有可能延長其總生存時間,靶向藥物的研發(fā)(索拉菲尼),索拉菲尼是靶向與血管內(nèi)皮生長因子的結(jié)合,抑制血管內(nèi)皮生長因子與其受體結(jié)合,抑制新生血管的生成,從而抑制腫瘤的生長。靶向藥物的研發(fā)對肝癌病人來說是一個福音。但是靶向藥物(索拉菲尼)的高昂費用以及其明顯的副作用,特別對于肝癌伴有明顯肝硬化的病人來說,會進一步加重肝功能的損害,因此限制了其在臨床的廣泛使用。由于我國仍然是一個發(fā)展中國家,多數(shù)病人無力承擔靶向藥物的高額費用,化療仍是大多數(shù)病人的第一選擇,但是肝癌對多數(shù)化療藥物不敏感,因此需要進一步探討新的治療肝癌的藥物或能增加肝癌對化療藥物的敏感性的藥物。欖香烯是從中藥溫莪術根莖中分離提取出來的揮發(fā)油,被國家批準的植物源性抗腫瘤藥物。欖香烯作為天然中草藥提取的有效成分,有著資源豐富,價格相對低廉等化學合成藥物不具備的優(yōu)良特性。欖香烯從分離提取后就廣泛用于臨床,為廣譜抗腫瘤藥物,有文章報道欖香烯對惡性腦膠質(zhì)瘤、宮頸癌、黑色素瘤、食管癌、胃癌、肺癌、卵巢癌等腫瘤有明顯的抗腫瘤作用,欖香烯主要通過抑制腫瘤細胞增殖、誘導腫瘤細胞凋亡以及抑制腫瘤細胞轉(zhuǎn)移等作用來發(fā)揮其抗腫瘤作用。欖香烯與其他抗腫瘤藥物有很大的區(qū)別,主要是欖香烯對于非腫瘤細胞的毒性很小,而且從多年的臨床資料來看,欖香烯對患者的骨髓以及肝腎功能影響很小。因此對于肝功能儲備差肝癌患者,不能耐受化療或者放療的肝癌患者,可以積極保肝的同時應用對肝功能影響小的抗腫瘤藥物來抑制腫瘤的生長,為肝臟能承受其他的治療來制造時間窗。另外一方面,欖香烯也可以聯(lián)合其他化療藥物對肝癌患者進行綜合治療。目前欖香烯在肝癌上的治療主要是通過TACE的方式將欖香烯聯(lián)合其他化療藥物灌注肝內(nèi),取得的效果優(yōu)于單用化療藥物。但是欖香烯抑制肝癌的作用目前仍不清楚,且欖香烯對肝癌的抗癌作用具體如何,這是我需要探討的問題。本實驗通過體外實驗來探討欖香烯對肝癌細胞的抗癌作用,體內(nèi)實驗通過建立小鼠肝癌原位移植模型,灌胃給藥的方式,觀察欖香烯對肝癌的抗癌的效果以及欖香烯聯(lián)合其他化療藥物的效果。研究方法和結(jié)果一、欖香烯對肝癌細胞的體外實驗的研究1、CCK8實驗觀測不同濃度的欖香烯對腹水型小鼠肝癌細胞H22的抑制增殖的作用,畫出曲線圖,估算其對H22細胞的半數(shù)抑制量約為30μg/ml。2、流式細胞儀檢測欖香烯處理H22細胞24小時后細胞凋亡的影響,結(jié)果發(fā)現(xiàn)相對對照組欖香烯處理后H22細胞凋亡增加。3、Transwell實驗觀察用欖香烯處理后對H22細胞遷移能力的影響,結(jié)果顯示用欖香烯處理后的H22細胞的遷移能力降低,P=0.013,P0.05,差異有統(tǒng)計學意義。4、欖香烯處理細胞后,RT-PCR實驗檢測腫瘤細胞內(nèi)AKT mRNA的表達量的變化。結(jié)果顯示欖香烯處理H22細胞相比于對照組AKT mRNA的表達量相對降低,P=0.064,P0.05,差異無統(tǒng)計學意義。5、欖香烯處理細胞后,Western-Blot實驗檢測腫瘤細胞內(nèi)AKT、p-AKT蛋白的量的變化,結(jié)果顯示：相比于對照組,H22細胞欖香烯處理后,AKT蛋白未見明顯變化,但是AKT蛋白的磷酸化水平明顯降低。二、欖香烯對肝細胞癌的體內(nèi)實驗的研究1、建立C57小鼠肝癌原位移植模型腹水型肝癌細胞株H22體外培養(yǎng)后,制成PBS細胞懸液,將細胞懸液注射至昆明鼠腹腔內(nèi)進行腹水傳代,傳至第三代的腹水細胞懸液在昆明鼠左前肢腋窩皮下接種,皮下成瘤后長至1cm后脫頸處死完整剝下腫瘤,切成1mm大小的瘤塊進行C57小鼠肝癌原位移植模型建立,其模型成瘤率90%。2、實驗分組模型建立后隨機分為四組,每組10只：A組為生理鹽水組,0.3m1/次/日；B組為欖香烯組,150mg/kg劑量即3mg/0.3ml/次/日；C組為替吉奧組,10mg/kg劑量即0.2mg/0.3ml/次/日；D組為欖香烯聯(lián)合替吉奧組,欖香烯150mg/kg,替吉奧5mg/kg劑量即欖香烯3mg-替吉奧0.1mg/0.3ml/次/日。3、觀察欖香烯對小鼠肝癌原位移植瘤的作用(1)模型建立后第2天開始,每日給小鼠灌胃一次,連續(xù)2周,灌胃過程中觀察小鼠的毛色以及生活狀態(tài),2周后稱重,并進行統(tǒng)計學分析。4%水合氯醛麻醉小鼠后完整取出肝臟,測量原位移植瘤的大小,進行統(tǒng)計學分析。結(jié)果表明：B組小鼠生活狀態(tài)及毛發(fā)與A組小鼠的生活狀態(tài)相似,毛發(fā)均光亮；D組小鼠的生活狀態(tài)明顯要強于C組,C的小鼠生活狀態(tài)明顯最差,且毛發(fā)暗淡無光澤；B組小鼠體重與A組相比,P=0.309,P0.05,差異無統(tǒng)計學意義,C組小鼠體重與其他三組比較,p值均0.001,差異均有統(tǒng)計學意義,D組小鼠體重與C組比較,P0.001,差異有統(tǒng)計學意義；B、C、D組C57小鼠肝臟腫瘤大小均小于A組小鼠肝臟腫瘤,p值均0.05,差異有統(tǒng)計學意義,B、C、D組C57小鼠肝臟腫瘤大小之間比較,p值均0.05,差異無統(tǒng)計學意義。(2)對C57小鼠肝臟腫瘤進行甲醛固定,HE染色觀察小鼠肝臟腫瘤的特點,以及腫瘤周圍肝臟有無衛(wèi)星灶。結(jié)果：腫瘤呈團片狀生長,核大深染,無明顯包膜。腫瘤呈團片狀生長,腫瘤細胞核大深染,周邊無明顯包膜,A組見腫瘤周邊有衛(wèi)星灶。A、C組腫瘤向周邊浸潤生長,B、D組腫瘤與周邊分界尚清,未見衛(wèi)星灶。結(jié)論實驗提示欖香烯有抑制腫瘤細胞增殖,具有誘導腫瘤細胞凋亡的作用,抑制腫瘤細胞轉(zhuǎn)移,其抑制肝癌細胞增殖的作用可能是通過PI3K/AKT信號通路,降低AKT蛋白的磷酸化水平即AKT激活減少使細胞周期停滯從而抑制腫瘤細胞增殖。本課題成功的建立了小鼠肝癌原位移植模型,超過90%的小鼠成功建模。建模后的小鼠給予欖香烯灌胃,相比于替吉奧,欖香烯副作用輕,且對腫瘤的抑制效果與替吉奧相當,欖香烯灌胃的小鼠的肝臟腫瘤大小也普遍小于生理鹽水組小鼠的肝臟腫瘤的大小。欖香烯協(xié)同替吉奧對肝細胞癌的抗癌作用效果明確,且比單用替吉奧組副作用小。
【關鍵詞】：肝細胞癌 欖香烯 細胞增殖 AKT p-AKT
【學位授予單位】：第二軍醫(yī)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R735.7
【目錄】：

• 摘要5-9
• Abstract9-13
• 縮略詞表13-14
• 前言14-17
• 第一部分 欖香烯對肝癌細胞的體外作用研究17-25
• 一、材料和方法17-21
• 二、實驗結(jié)果21-25
• 第二部分 建立小鼠肝癌原位移植模型以及欖香烯對肝癌體內(nèi)實驗研究25-31
• 一、材料和方法25-28
• 二、實驗結(jié)果28-31
• 討論31-33
• 結(jié)論33-34
• 參考文獻34-38
• 綜述38-45
• 參考文獻42-45
• 附錄45-47
• 在讀期間發(fā)表的論文47-48
• 致謝48

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