發(fā)布時間：2017-09-10 18:13

  本文關(guān)鍵詞：酒精誘導人肝癌SMMC-7721細胞凋亡過程中自噬的研究

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【摘要】：目的:使用不同濃度的酒精作用于人肝癌細胞SMMC-7721,觀察細胞凋亡過程中自噬的發(fā)生。方法:四甲偶氮唑鹽比色法(MTT)檢測酒精對SMMC-7721細胞生存率的影響;DAPI染色觀察細胞凋亡;間接免疫熒光法觀察細胞自噬標志物LC3與p62表達變化;透射電鏡觀察細胞中自噬體的超微結(jié)構(gòu);蛋白免疫印跡法(Western-Blot)定量檢測LC3與p62蛋白量表達。結(jié)果:酒精濃度分別為100 mmol/L、200 mmol/L、400 mmol/L和800 mmol/L,處理SMMC-7721細胞24h,與0 mmol/L酒精濃度組比較,細胞生存率分別為76.35%(P0.05)、56.25%(P0.01)、45.22%(P0.01)和38.42%(P0.01),酒精可顯著抑制SMMC-7721細胞的增殖,生存率呈濃度依賴性。DAPI染細胞核,隨酒精濃度增加可見典型細胞凋亡特征性變化,凋亡率較對照組有顯著差異(P0.05),酒精可顯著誘導SMMC-7721細胞凋亡;間接免疫熒光觀察酒精致SMMC-7721細胞自噬,自噬標志物LC3在細胞核附近密度增高,p62在細胞質(zhì)中也有增加,并且可見LC3與p62點狀共定位;Western-Blot結(jié)果顯示,不同酒精濃度處理SMMC-7721細胞2h時,LC3-II和p62的表達量在200 mmol/L時都達到最高,較去血清對照組有統(tǒng)計學意義(P0.05),LC3-I表達量降低但無統(tǒng)計學意義(P0.05);酒精濃度200 mmol/L處理SMMC-7721細胞不同時間,LC3表達量較去血清對照組有顯著增加,p62表達量在2h和6h明顯增加,之后逐漸降低;使用單純?nèi)パ迮囵B(yǎng)基對照處理相同時間,LC3表達量較去血清對照組有顯著增加,但趨勢與含酒精組不同,p62表達量在2h和6h明顯增加,但增加程度有所降低;透射電鏡也觀察到SMMC-7721細胞中有自噬體存在。結(jié)論:酒精顯著誘導SMMC-7721細胞凋亡;酒精誘導SMMC-7721細胞凋亡過程中有自噬發(fā)生。
【關(guān)鍵詞】：自噬 酒精 LC3 p62 SMMC-7721
【學位授予單位】：河南大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R735.7
【目錄】：

• 摘要4-5
• Abstract5-9
• 引言9-12
• 1 實驗材料、試劑和儀器12-17
• 1.1 細胞株12
• 1.2 主要儀器設(shè)備12-13
• 1.3 主要試劑與實驗材料13-14
• 1.4 主要試劑配制方法14-17
• 1.4.1 細胞培養(yǎng)基14
• 1.4.2 磷酸鹽緩沖液（PBS）14
• 1.4.3 MTT工作液14
• 1.4.4 30% Acr-Bis14
• 1.4.5 分離膠緩沖液14
• 1.4.6 濃縮膠緩沖液14-15
• 1.4.7 1.0 mol/L Tris·HCl，pH 7.515
• 1.4.8 10% SDS15
• 1.4.9 2×轉(zhuǎn)移電泳緩沖液15
• 1.4.10 10×電泳緩沖液15
• 1.4.11 10×TBS緩沖液15
• 1.4.12 TBST緩沖液15
• 1.4.13 Epon812樹脂15-17
• 2 實驗方法17-21
• 2.1 MTT法檢測細胞生存率17
• 2.2 DAPI染色檢測細胞凋亡17
• 2.3 間接免疫熒光檢測LC3與p62的表達及定位17-18
• 2.4 透射電鏡觀察自噬體形態(tài)學特征18
• 2.5 Western-Blot檢測LC3與p62蛋白表達量18-20
• 2.5.1 蛋白樣品的制備和定量18-19
• 2.5.2 SDS-PAGE及轉(zhuǎn)移電泳19-20
• 2.5.3 抗體雜交和發(fā)光檢測20
• 2.6 統(tǒng)計學方法20-21
• 3 結(jié)果21-33
• 3.1 酒精對SMMC-7721細胞生存率的影響21-22
• 3.2 酒精誘導SMMC-7721細胞凋亡22-23
• 3.3 自噬體的超微結(jié)構(gòu)23
• 3.4 間接免疫熒光法觀察酒精對SMMC-7721細胞LC3的影響23-24
• 3.5 間接免疫熒光法觀察酒精對SMMC-7721細胞p62的影響24
• 3.6 SMMC-7721細胞中LC3與p62的共定位24-25
• 3.7 Western-Blot法檢測酒精對SMMC-7721細胞LC3的影響25-28
• 3.8 Western-Blot法檢測酒精對SMMC-7721細胞p62的影響28-33
• 4 討論33-35
• 5 結(jié)論35-37
• 參考文獻37-41
• 文獻綜述41-67
• 參考文獻55-67
• 附錄A 英文縮略詞表67-69
• 致謝69-71
• 攻讀學位期間發(fā)表的學術(shù)論文71-72

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本文編號：825849