本文關鍵詞：基于腫瘤多藥耐藥機制構建多孔微球和苯硼酸靶向型小核酸遞釋體系的研究

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【摘要】：腫瘤多藥耐藥現(xiàn)象是腫瘤臨床治療中的主要屏障,會造成腫瘤細胞對化療藥物產(chǎn)生交叉耐藥。多藥耐藥現(xiàn)象的機制十分復雜,主要是藥物外排泵蛋白和抗凋亡蛋白在腫瘤細胞內的過表達所導致的。小核酸類藥物,如si RNA和mi RNA能夠有效針對胞內某種蛋白的表達進行靶向沉默,故而成為逆轉多藥耐藥的理想工具。以多藥耐藥現(xiàn)象的分子機制為指導,設計構建高效的小核酸遞釋體系成為一項極具潛力的探索性研究�；谏鲜隹紤],本論文首先以雙功能PEG作為交聯(lián)劑,將苯硼酸靶向基團連接到樹枝狀高分子材料PAMAM表面,設計構建了一種對腫瘤細胞具有特異性靶向功能的小核酸藥物載體PPP。該載體具有良好的si RNA結合和保護能力,能夠抵抗RNA酶和血清對si RNA分子的降解并有效促進Bcl-2 si RNA的胞吞進而提升轉染效率。通過對Bcl-2基因表達的高效沉默,該遞釋體系顯著提升了Hep G2細胞對阿霉素的藥物敏感度,抑制了多藥耐藥現(xiàn)象的發(fā)生,最終介導了細胞凋亡從而實現(xiàn)對腫瘤細胞增殖的有效抑制。隨后,為了提高化療藥物的生物利用度,我們以PLGA為材料,使用碳酸氫銨作為造孔劑,針對給藥困難的肺部腫瘤設計構建了可吸入式化療藥物與小核酸共載的多孔空心微球遞釋體系。該多孔空心PLGA微球展現(xiàn)了對阿霉素和mi R-519c良好的包載率和穩(wěn)定的緩釋作用。通過增殖抑制、細胞凋亡和周期阻滯等細胞生物學水平的檢測,共載微球釋放液對肺癌細胞A549具有顯著的增殖抑制和殺傷效果,并展示了良好的藥物與基因協(xié)同作用效果。胞內阿霉素濃度的檢測顯示,mi R-519c的引入能夠有效抑制ABCG2對阿霉素的外排作用,提高胞內阿霉素的濃度,抑制多藥耐藥現(xiàn)象的產(chǎn)生。綜上,以腫瘤多藥耐藥機制為指導的小核酸遞釋體系能夠有效實現(xiàn)藥物與基因的遞送,通過抑制多藥耐藥現(xiàn)象的發(fā)生極大地提高了對腫瘤細胞的抑制和殺傷效果。以上研究,為構建針對腫瘤多藥耐藥的藥物與基因遞釋體系提供了新的策略和方法,證明了藥物與基因遞釋體系在腫瘤治療領域的巨大潛力,為未來的臨床應用奠定了良好的基礎。
【關鍵詞】：多藥耐藥 小核酸 基因治療 靶向遞送 共遞送
【學位授予單位】：吉林大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R730.5
【目錄】：

• 摘要4-6
• Abstract6-12
• 第一章 緒論12-32
• 1.1 腫瘤耐藥機制的形成及相關關鍵基因13-21
• 1.1.1 腫瘤耐藥機制的形成13-15
• 1.1.2 腫瘤耐藥機制相關關鍵基因15-21
• 1.2 遞釋體系在逆轉腫瘤多藥耐藥中的應用21-25
• 1.2.1 MDR蛋白抑制劑的遞釋體系22-23
• 1.2.2 靶向MDR蛋白的小核酸藥物遞釋體系23-24
• 1.2.3 調控藥物攝取途徑的納米粒子遞釋體系24-25
• 1.3 藥物與基因的協(xié)同作用及共遞送體系25-30
• 1.3.1 脂質材料共遞送體系26-27
• 1.3.2 樹枝狀高分子材料共遞送體系27-29
• 1.3.3 聚合物材料共遞送體系29-30
• 1.4 本課題研究思路30-32
• 第二章 苯硼酸靶向型PAMAM遞送體系介導Bcl-2 siRNA與阿霉素共給藥抑制腫瘤細胞增殖的研究32-57
• 2.1 引言32-33
• 2.2 實驗材料33-35
• 2.2.1 細胞株33
• 2.2.2 小干擾RNA（siRNA）33
• 2.2.3 主要試劑33-34
• 2.2.4 實驗器材34
• 2.2.5 主要溶液的配制34-35
• 2.3 實驗方法35-41
• 2.3.1 細胞培養(yǎng)35-36
• 2.3.2 苯硼酸修飾PAMAM的合成與表征36-37
• 2.3.3 ICP-MS硼元素檢測37
• 2.3.4 凝膠電泳分析37
• 2.3.5 細胞毒性分析37-38
• 2.3.6 流式細胞術分析38
• 2.3.7 激光共聚焦顯微鏡分析38
• 2.3.8 唾液酸抗原表達水平檢測38
• 2.3.9 反轉錄 PCR（RT-PCR）和反轉錄定量 PCR（q RT-PCR）38-39
• 2.3.10 蛋白質印記檢測39-40
• 2.3.11 Bcl-2 siRNA轉染抑制腫瘤細胞增殖40
• 2.3.12 Bcl-2 siRNA轉染介導腫瘤細胞凋亡40
• 2.3.13 Live/Dead細胞染色40
• 2.3.14 數(shù)據(jù)的統(tǒng)計學分析40-41
• 2.4 實驗結果與討論41-55
• 2.4.1 PPP載體的合成與表征41-46
• 2.4.2 PPP/siRNA納米粒子的胞吞行為研究46-51
• 2.4.3 PPP/siRNA納米粒子靶向沉默Bcl-2 基因51-52
• 2.4.4 PPP/siRNA納米粒子抑制腫瘤細胞增殖52-55
• 2.5 本章小結55-57
• 第三章 可吸入式多孔空心PLGA微球藥物與基因共遞送體系的構建與評價57-79
• 3.1 引言57-58
• 3.2 實驗材料58-59
• 3.2.1 質粒與細胞株58
• 3.2.2 主要試劑58-59
• 3.2.3 實驗儀器59
• 3.2.4 主要試劑的配制59
• 3.3 實驗方法59-64
• 3.3.1 細胞培養(yǎng)59
• 3.3.2 pcDNA-miR-519c質粒提取59
• 3.3.3 多孔空心PLGA微球的制備59-60
• 3.3.4 多孔空心PLGA微球的表征60
• 3.3.5 多孔空心PLGA微球的載藥量和包封率測定60-61
• 3.3.6 微球體外藥物釋放61
• 3.3.7 微球釋放液抑制腫瘤細胞增殖61-62
• 3.3.8 微球釋放液誘導腫瘤細胞凋亡62
• 3.3.9 微球釋放液誘導腫瘤細胞周期阻滯62-63
• 3.3.10 微球釋放液誘導腫瘤細胞相關蛋白表達量變化63
• 3.3.11 微球釋放液誘導腫瘤細胞Caspase家族蛋白活性變化63
• 3.3.12 微球釋放液促進阿霉素在腫瘤細胞中的富集63-64
• 3.3.13 數(shù)據(jù)的統(tǒng)計學分析64
• 3.4 實驗結果與討論64-78
• 3.4.1 多孔空心PLGA微球的制備與表征64-69
• 3.4.2 微球釋放液抑制腫瘤細胞增殖69-71
• 3.4.3 微球釋放液誘導A549細胞周期阻滯及凋亡71-74
• 3.4.4 微球釋放液抑制A549細胞的分子機制研究74-75
• 3.4.5 藥物與基因共遞送體系影響阿霉素的胞內富集75-78
• 3.5 本章小結78-79
• 全文總結79-81
• 參考文獻81-91
• 碩士期間的科研成果與獎勵91-93
• 致謝93

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