本文關(guān)鍵詞：miR-155-5p調(diào)控骨髓間質(zhì)干細(xì)胞向胃癌間質(zhì)干細(xì)胞轉(zhuǎn)分化的作用及機(jī)制研究

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【摘要】：目的:闡明骨髓間質(zhì)干細(xì)胞(BM-MSC)向胃癌間質(zhì)干細(xì)胞(GC-MSC)轉(zhuǎn)分化的分子調(diào)控機(jī)制,基于胃癌微環(huán)境探尋胃癌治療新靶標(biāo)。方法:采用免疫熒光檢測(cè)α-SMA、FAP的表達(dá),定量PCR檢測(cè)細(xì)胞因子的表達(dá),Transwell遷移實(shí)驗(yàn)和侵襲實(shí)驗(yàn)檢測(cè)胃癌細(xì)胞遷移及侵襲能力的改變,應(yīng)用克隆形成實(shí)驗(yàn)和裸鼠皮下致瘤實(shí)驗(yàn)檢測(cè)胃癌細(xì)胞增殖能力的改變來確定BM-MSC與GC-MSC表型和功能的差異。通過定量PCR檢測(cè)比較BM-MSC與GC-MSC中miR-155-5p表達(dá)的差異。運(yùn)用miR-155-5p micmis在GC-MSC中上調(diào)miR-155-5p的表達(dá),miR-155-5p inhibitor在BM-MSC中下調(diào)miR-155-5p的表達(dá),分析MSC表型、功能的變化,確定miR-155-5p對(duì)BM-MSC向GC-MSC轉(zhuǎn)分化的調(diào)控作用。采用picTar和TargetScan軟件預(yù)測(cè)和熒光報(bào)告素酶基因檢測(cè)驗(yàn)證并確定miR-155-5p調(diào)控的靶基因。采用靶基因干擾片段或抑制劑與miR-155-5p inhibitor共轉(zhuǎn)染BM-MSC,檢測(cè)其表型和功能的變化,闡明miR-155-5p調(diào)控BM-MSC向GC-MSC轉(zhuǎn)分化的分子機(jī)制。采用免疫組織化學(xué)方法分別檢測(cè)彌散型、腸型胃癌組織標(biāo)本和胃炎標(biāo)本MSC中靶基因的表達(dá),分析靶基因與胃癌分型的關(guān)系。從胃癌及癌旁組織中分離培養(yǎng)出GC-MSC與GCN-MSC,Western blot檢測(cè)靶基因的表達(dá)差異。采用靶基因抑制劑或下游效應(yīng)分子干擾片段處理GC-MSC,檢測(cè)其表型和功能的改變,闡明miR-155-5p調(diào)控的相關(guān)信號(hào)分子維持GC-MSC的表型和功能的作用及機(jī)制。結(jié)果:GC-MSC與BM-MSC相比,具有更強(qiáng)的基質(zhì)細(xì)胞活化表型和促進(jìn)胃癌細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移的能力。miR-155-5p在GC-MSC中低表達(dá),BM-MSC轉(zhuǎn)染miRNA-155-5p inhibitor后可獲得GC-MSC樣表型和功能,相反,運(yùn)用miR-155-5p mimics上調(diào)GC-MSC中mi RNA-155-5p的表達(dá)可削弱其表型和對(duì)胃癌細(xì)胞的作用。NF-kappa B p65(NF-κB p65)和inhibitor of NF-kappa B kinase subunit epsilon(IKBKE/IKKε)被預(yù)測(cè)并驗(yàn)證為miR-155-5p的靶基因。使用si-NF-κB p65或si-IKBKE作用于BM-MSC可以抑制miR-155-5p inhibitor對(duì)其轉(zhuǎn)分化的調(diào)控作用,這種作用也可以被NF-κB p65活化抑制劑PDTC所抑制。IKBKE、NF-κB p65和phospho-NF-κB p65在彌散型胃癌組織MSC中的表達(dá)高于腸型胃癌組織MSC,陽性率分別為83.5%、80.8%和65.0%,而它們?cè)谖秆捉M織MSC中幾乎不表達(dá),陽性率僅為19.3%,0%和4%。miR-155-5p在GC-MSC中表達(dá)下調(diào),而NF-κB p65表達(dá)上調(diào)且活化增加,抑制NF-κB p65的活化或其下游關(guān)鍵效應(yīng)因子的表達(dá)可以逆轉(zhuǎn)GC-MSC的表型和功能。結(jié)論:GC-MSC較BM-MSC具有更強(qiáng)的促癌表型、功能和低表達(dá)miR-155-5p。BM-MSC中miR-155-5p的低表達(dá)可上調(diào)IKBKE和NF-κB p65的表達(dá)并促進(jìn)NF-κB p65的活化,進(jìn)而促進(jìn)其獲得GC-MSC樣表型和功能,靶向抑制GC-MSC中NF-κB p65的活化或下游效應(yīng)因子的表達(dá)可逆轉(zhuǎn)其促癌表型和功能。為GC-MSC在胃癌微環(huán)境中的重塑提供了新的機(jī)制,也為胃癌的治療提供了有效靶點(diǎn)和治療途徑。
【關(guān)鍵詞】：miR-155-5p 骨髓間質(zhì)干細(xì)胞 胃癌間質(zhì)干細(xì)胞 腫瘤微環(huán)境 轉(zhuǎn)分化
【學(xué)位授予單位】：江蘇大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R735.2
【目錄】：

• 摘要5-7
• ABSTRACT7-16
• 第一章 緒論16-25
• 1.1 MSC與腫瘤微環(huán)境16-19
• 1.1.1 腫瘤微環(huán)境的組成16
• 1.1.2 MSC參與腫瘤微環(huán)境的形成16-18
• 1.1.3 MSC與癌相關(guān)成纖維細(xì)胞(cancer-associated fibroblast, CAF)18-19
• 1.2 miRNA與腫瘤微環(huán)境19-21
• 1.2.1 miRNA與腫瘤微環(huán)境19-20
• 1.2.2 miR1555p與腫瘤微環(huán)境20-21
• 1.3 研究目的、方法、技術(shù)路線及意義21-25
• 1.3.1 研究目的21
• 1.3.2 研究方法21
• 1.3.3 實(shí)驗(yàn)方案21-23
• 1.3.4 預(yù)期結(jié)果及研究意義23-25
• 第二章 GC-MSC與BM-MSC表型和功能差異25-37
• 2.1 材料25-28
• 2.1.1 標(biāo)本的采集25
• 2.1.2 主要試劑25-27
• 2.1.3 主要儀器及相關(guān)耗材27
• 2.1.4 細(xì)胞株27-28
• 2.1.5 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物28
• 2.2 方法28-33
• 2.2.1 BM-MSC的分離培養(yǎng)28
• 2.2.2 GC-MSC與GCN-MSC的分離培養(yǎng)28
• 2.2.3 MSC表面標(biāo)記鑒定28-29
• 2.2.4 成骨細(xì)胞誘導(dǎo)29
• 2.2.5 成脂細(xì)胞誘導(dǎo)29
• 2.2.6 細(xì)胞培養(yǎng)29
• 2.2.7 MSC上清的制備29-30
• 2.2.8 免疫熒光30
• 2.2.9 mRNA的提取30
• 2.2.10 mRNA逆轉(zhuǎn)錄30-31
• 2.2.11 mRNA熒光實(shí)時(shí)定量PCR31
• 2.2.12 克隆形成實(shí)驗(yàn)31
• 2.2.13 transwell遷移實(shí)驗(yàn)31-32
• 2.2.14 transwell侵襲實(shí)驗(yàn)32
• 2.2.15 裸鼠皮下致瘤模型32
• 2.2.16 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析32-33
• 2.3 結(jié)果33-35
• 2.3.1 BM-MSC、GC-MSC與GCN-MSC的鑒定33-34
• 2.3.2 BM-MSC與GC-MSC表型的差異34
• 2.3.3 BM-MSC與GC-MSC功能的差異34-35
• 2.4 討論35-37
• 第三章 miR1555p的下調(diào)促進(jìn)BM-MSC向GC-MSC轉(zhuǎn)分化37-45
• 3.1 材料37
• 3.1.1 主要試劑37
• 3.2 方法37-40
• 3.2.1 寡核苷酸片段配置38
• 3.2.2 細(xì)胞轉(zhuǎn)染38
• 3.2.3 miRNA的提取38-39
• 3.2.4 miRNA逆轉(zhuǎn)錄39
• 3.2.5 miRNA熒光實(shí)時(shí)定量PCR39-40
• 3.3 結(jié)果40-43
• 3.3.1 miR1555p在GC-MSC中表達(dá)下調(diào)40
• 3.3.2 miR1555p的下調(diào)促進(jìn)BM-MSC獲得GC-MSC樣表型40-41
• 3.3.3 miR1555p的下調(diào)促進(jìn)BM-MSC獲得GC-MSC樣功能41-43
• 3.4 討論43-45
• 第四章 miR1555p的下調(diào)靶向激活NF-κB p65促進(jìn)BM-MSC向GC-MSC轉(zhuǎn)分化45-61
• 4.1 材料45-46
• 4.1.1 主要試劑45-46
• 4.1.2 主要儀器及相關(guān)耗材46
• 4.1.3 細(xì)胞株46
• 4.2 方法46-51
• 4.2.1 靶基因預(yù)測(cè)46
• 4.2.2 靶基因報(bào)告基因載體的構(gòu)建46-49
• 4.2.3 報(bào)告基因載體轉(zhuǎn)染49
• 4.2.4 啟動(dòng)子報(bào)告基因載體的構(gòu)建與轉(zhuǎn)染49
• 4.2.5 報(bào)告基因檢測(cè)49
• 4.2.6 細(xì)胞蛋白提取49-50
• 4.2.7 Western blot50
• 4.2.8 si-RNA的轉(zhuǎn)染50
• 4.2.9 PDTC的配制50-51
• 4.2.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析51
• 4.3 結(jié)果51-59
• 4.3.1 miR1555p靶向調(diào)控NF-κB p6551-52
• 4.3.2 si-NF-κB p65對(duì)BM-MSC轉(zhuǎn)分化作用的影響52-54
• 4.3.3 miR1555p的下調(diào)促進(jìn)NF-κBp65的活化54-55
• 4.3.4 PDTC對(duì)BM-MSC轉(zhuǎn)分化作用的影響55-56
• 4.3.5 miR1555p靶向調(diào)控IKBKE56-57
• 4.3.6 si-IKBKE對(duì)BM-MSC轉(zhuǎn)分化作用的影響57-59
• 4.4 討論59-61
• 第五章 GC-MSC表型和功能的維持依賴于NF-κB p65的持續(xù)活化61-71
• 5.1 材料61-62
• 5.1.1 主要試劑61-62
• 5.1.2 主要儀器及相關(guān)耗材62
• 5.1.3 細(xì)胞株62
• 5.2 方法62-63
• 5.2.1 免疫組織化學(xué)62-63
• 5.2.2 si-RNA轉(zhuǎn)染63
• 5.3 結(jié)果63-69
• 5.3.1 胃癌標(biāo)本中IKBKE、NF-κB p65、phospho-NF-κB p65的表達(dá)63-65
• 5.3.2 PDTC對(duì)GC-MSC的作用65-67
• 5.3.3 NF-κB p65下游通路的活化對(duì)GC-MSC的作用67-69
• 5.4 討論69-71
• 第六章 結(jié)論和展望71-73
• 6.1 結(jié)論71
• 6.2 展望71-73
• 參考文獻(xiàn)73-80
• 致謝80-81
• 攻讀碩士學(xué)位期間發(fā)表的學(xué)術(shù)論文及參加會(huì)議81

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