本文關(guān)鍵詞：多被銀蓮花總皂甙對人涎腺腺樣囊性癌高肺轉(zhuǎn)移癌細(xì)胞凋亡的影響

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【摘要】：目的:涎腺腺樣囊性癌(salivary adenoid cystic carcinoma,SACC),是最常見的涎腺惡性腫瘤之一,該腫瘤具有侵襲性強、浸潤性生長,早期沿神經(jīng)及血管向遠(yuǎn)處擴展和轉(zhuǎn)移等特征。腫瘤常經(jīng)血行轉(zhuǎn)移至肺而嚴(yán)重危害人類健康。目前尋找可口服、副作用小、可長期應(yīng)用的抗腫瘤藥物一直是口腔醫(yī)學(xué)界研究的熱門課題之一。多被銀蓮花(Anemone Raddeanin Regel,ARR)是中藥毛茛科植物的干燥根莖,藥材味辛、熱、有毒、歸脾經(jīng),具有祛風(fēng)濕、消腫痛之功效。多被銀蓮花提取物總皂甙(Anemone Raddeanin Regel Extracts,ARRE)是多被銀蓮花經(jīng)水解和溶劑萃取而來。藥理活性研究發(fā)現(xiàn)多被銀蓮花總皂甙有抗腫瘤、鎮(zhèn)痛、鎮(zhèn)靜及抗驚厥作用。多被銀蓮花總皂甙體外實驗結(jié)果顯示水溶性總皂甙對兔腦c AMP-PDE的生長具有明顯的抑制效果,最高可達(dá)61.3%。另有體外實驗表明多被銀蓮花總皂甙能夠明顯抑制人癌細(xì)胞KB、HCT-8、MCF-7/WT和MCF-7/ADR細(xì)胞株的生長。而在小鼠的動物實驗中多被銀蓮花總皂甙對肉瘤S180、肝癌H22和艾氏腹水癌EAC具有明顯的抑瘤效果,其抑瘤率分別達(dá)68.1%、62.5%、69.3%。目前關(guān)于多被銀蓮花提取物總皂甙對腺樣囊性癌癌細(xì)胞作用的研究鮮有報道。本實驗采用水解和溶劑萃取的方法,從中藥多被銀蓮花中提取分離得到總皂甙。通過對體外培養(yǎng)的人涎腺腺樣囊性癌高肺轉(zhuǎn)移株(Adenoid cystic carcinoma of high pulmonary metastatic,ACC-M)經(jīng)不同濃度、不同時間的多被銀蓮花總皂甙處理后,采用MTT法、倒置相差顯微鏡觀察法、吉姆薩染色法、Annexin-V-FITC和PI雙標(biāo)記活細(xì)胞法檢測細(xì)胞凋亡情況,觀察不同濃度、不同作用時間下多被銀蓮花總皂甙是否對ACC-M細(xì)胞系有誘導(dǎo)凋亡作用。探討中藥對高肺轉(zhuǎn)移腺樣囊性癌細(xì)胞的作用,為防治腺樣囊性癌遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移提供一種有效的方法和途徑。方法:1材料ACC-M細(xì)胞:北京大學(xué)口腔醫(yī)院提供;多被銀蓮花總皂甙:購買于石家莊樂仁堂藥店(產(chǎn)地為黑龍江省),于河北醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院經(jīng)溶解與溶劑萃取提純得到。2方法2.1實驗藥物的配制:多被銀蓮花總皂甙用含有二甲基亞砜(DMSO)的RPMI1640細(xì)胞培養(yǎng)液溶解配制成20mg/m L儲存液,4℃保存,使用前用培養(yǎng)液稀釋(DMSO0.001%,對細(xì)胞無影響)。2.2 ACC-M細(xì)胞培養(yǎng):在37℃、5%CO2恒溫箱及飽和濕度條件下培養(yǎng),10%胎牛血清和青霉素(100U/m L)、鏈霉素(100μg/m L)加入至RPMI1640培養(yǎng)基中,24h~48h傳1代,用0.04%EDTA和0.25%胰蛋白酶(1:1)混合,其混合液用于消化傳代。2.3 MTT比色試驗:參考細(xì)胞生長曲線,應(yīng)用對數(shù)生長期的細(xì)胞制成2.0×105/L細(xì)胞懸液,然后將其接種于96孔板,每孔100u L,培養(yǎng)24h,于實驗組中加入多被銀蓮花總皂甙100u L,使藥物濃度分別為1ug/m L、25ug/m L、50ug/m L、75ug/m L、100ug/m L,并設(shè)置對照組和調(diào)零孔,每組5個復(fù)孔。繼續(xù)培養(yǎng)24h、48h、72h后,每孔中加入5g/L的預(yù)制MTT溶液20u L,繼續(xù)培養(yǎng)4h后吸去各孔中全部上清液,然后在各孔中加入200u L二甲基亞砜溶液,于振蕩器上振蕩搖勻,使結(jié)晶充分溶解,將96孔板置于酶標(biāo)儀上測各孔吸光度值并計算各組的生長抑制率,按作圖法求出不同處理時間的IC50(生長抑制率為50%的藥物濃度)。2.4倒置相差顯微鏡觀察:將ACC-M細(xì)胞接種于50m L培養(yǎng)瓶中,應(yīng)用倒置顯微鏡觀察ACC-M細(xì)胞在不同藥物濃度及不同培養(yǎng)時間下,實驗組與對照組細(xì)胞生長狀況。2.5吉姆薩染色法:將ACC-M細(xì)胞接種于6孔板中,各孔中放置蓋玻片,細(xì)胞在蓋玻片上爬片成功后分別在各孔中加入空白或含藥培養(yǎng)基,細(xì)胞培養(yǎng)不同時間后,經(jīng)吉姆薩染色,最后通過光學(xué)顯微鏡觀察。2.6流式細(xì)胞術(shù)檢測:采用處于對數(shù)生長期的ACC-M細(xì)胞,將細(xì)胞分別接種于50m L細(xì)胞培養(yǎng)瓶中,設(shè)計實驗為兩組即時間對照組和濃度對照組,通過Annexin-V-FITC和PI雙標(biāo)記活細(xì)胞,采用流式細(xì)胞儀檢測經(jīng)藥物處理后不同時間、不同濃度下細(xì)胞凋亡情況。3統(tǒng)計分析實驗結(jié)果采用SPSS10.0統(tǒng)計學(xué)軟件進(jìn)行統(tǒng)計,每次實驗重復(fù)3次,實驗數(shù)據(jù)以均值±標(biāo)準(zhǔn)差(x±SD)表示,分別對生長抑制率、吸光度值和凋亡率進(jìn)行t檢驗和單因素方差分析。結(jié)果:1 MTT比色試驗:實驗表明多被銀蓮花總皂甙藥物作用24h、48h、72h后的IC50分別約為46.3 ug/m L、56.59 ug/m L、44.60 ug/m L,其最高抑制率可達(dá)90.3%(Fig.1)。統(tǒng)計分析結(jié)果顯示,各時間組不同濃度之間的吸光度值有顯著性差異(P0.05),各濃度組不同處理時間之間生長抑制率有顯著性差異(P0.05),多被銀蓮花總皂甙的藥效與其濃度和作用時間具有明顯正相關(guān)性。根據(jù)各時間組的IC50結(jié)果設(shè)計實驗組藥物作用濃度分別為25ug/m L、50ug/m L、75ug/m L。2倒置顯微鏡觀察結(jié)果:對照組培養(yǎng)的細(xì)胞貼壁生長,呈“鋪路石”樣分布,細(xì)胞呈多角形,胞質(zhì)飽滿,細(xì)胞生長迅速,近中央處可見細(xì)胞核;實驗組培養(yǎng)的細(xì)胞貼壁生長能力減弱,培養(yǎng)液中可見細(xì)胞懸浮脫落,貼壁細(xì)胞變圓,胞質(zhì)皺縮,細(xì)胞變小,生長速度減慢,胞核顏色加深,細(xì)胞折光性增加。3吉姆薩染色結(jié)果:對照組細(xì)胞可見多個胞核,核質(zhì)比增高;實驗組細(xì)胞出現(xiàn)胞質(zhì)濃縮、核質(zhì)比降低現(xiàn)象,細(xì)胞核減少甚至消失,染色質(zhì)沿核膜內(nèi)側(cè)排列。4流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果:對照組細(xì)胞也出現(xiàn)凋亡,但凋亡率較低,最高達(dá)20.96%;實驗組細(xì)胞凋亡明顯,其凋亡率隨著藥物作用濃度與作用時間的增加而增高,最高達(dá)34.0%,經(jīng)統(tǒng)計學(xué)分析,各濃度組與各時間組之間有顯著性差異(P0.05)。結(jié)論:多被銀蓮花總皂甙可以抑制人涎腺腺樣囊性癌細(xì)胞株(ACC-M)的增殖,具有抑制增殖、誘導(dǎo)其凋亡的作用,且呈濃度和時間依賴性。
【關(guān)鍵詞】：多被銀蓮花 腺樣囊性癌 總皂甙 凋亡 增殖
【學(xué)位授予單位】：河北醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R739.8
【目錄】：

• 中文摘要4-7
• 英文摘要7-11
• 英文縮寫11-12
• 前言12-13
• 材料與方法13-21
• 結(jié)果21-23
• 附圖23-28
• 附表28-30
• 討論30-33
• 結(jié)論33
• 參考文獻(xiàn)33-35
• 綜述 多被銀蓮花的主要化學(xué)成分及藥理作用35-42
• 參考文獻(xiàn)39-42
• 致謝42-43
• 個人簡歷43

【參考文獻(xiàn)】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 林小欽;李東良;楊才生;何秀華;方堅;;竹節(jié)香附素A對人肝癌細(xì)胞HepG_2增殖的抑制作用[J];現(xiàn)代藥物與臨床;2009年01期

2 王明奎;丁立生;吳鳳鍔;;兩頭尖總苷的抗腫瘤活性研究[J];應(yīng)用與環(huán)境生物學(xué)報;2008年03期

3 周鴻立;孫永旭;李勇;王賓;劉大有;;兩頭尖的化學(xué)成分及藥理作用研究進(jìn)展[J];時珍國醫(yī)國藥;2007年05期

4 張勤麗;牛僑;;細(xì)胞凋亡機制概述[J];環(huán)境與職業(yè)醫(yī)學(xué);2007年01期

5 張翠卿;唐東平;;腫瘤體外藥敏試驗與臨床優(yōu)化治療方案的研究進(jìn)展[J];四川腫瘤防治;2006年04期

6 任風(fēng)芝;張雪霞;牛桂云;張麗;單保恩;劉剛?cè)?;兩頭尖的抗腫瘤活性成分研究[J];中草藥;2005年12期

7 毛詠秋,姜愚,雷松,闞兵;流式細(xì)胞術(shù)PI、Annexin V/PI和APO2.7法檢測細(xì)胞凋亡的比較[J];華西醫(yī)學(xué);2005年03期

8 郭以河,張閩峰,孟家榕;MTT法體外藥敏試驗研究進(jìn)展及臨床應(yīng)用[J];東南國防醫(yī)藥;2005年01期

9 冉忠梅,陳金斗,劉宇;兩頭尖抗炎活性的初步測試[J];中國民族民間醫(yī)藥雜志;2000年05期

10 匡海學(xué),田振坤,張寧;兩頭尖的化學(xué)成分研究[J];中草藥;1996年06期

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本文編號：808830