本文關(guān)鍵詞：PAX2、AIB1在人乳腺癌細(xì)胞生長及他莫昔芬治療作用的實驗研究

  更多相關(guān)文章： AIB-1 PAX-2 HER2 重組質(zhì)粒 穩(wěn)定轉(zhuǎn)染 MCF-7細(xì)胞 細(xì)胞增殖 三苯氧胺耐藥

【摘要】：目的:乳腺癌是全球女性最常見的惡性腫瘤,嚴(yán)重危害著女性的生命和健康。近年來我國乳腺癌的發(fā)病率持續(xù)上升,且發(fā)病年齡呈年輕化。乳腺癌是內(nèi)分泌依賴性腫瘤,雌激素會刺激乳腺癌的發(fā)生與發(fā)展,并增加乳腺癌的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的機(jī)率。相比于細(xì)胞毒性藥物治療,內(nèi)分泌治療具有其副作用小、方便服用、效應(yīng)持久,對患者生活質(zhì)量影響小等優(yōu)點(diǎn),成為乳腺癌最重要的治療手段之一。他莫昔芬(三苯氧胺,tamoxifen TAM)是一種選擇性雌激素受體調(diào)變劑,用于絕經(jīng)前雌激素受體(estrogen receptor,ER)陽性的乳腺癌患者的內(nèi)分泌治療。目前臨床上約40%~50%ER陽性的乳腺癌患者對抗雌激素治療產(chǎn)生耐藥。但TAM耐藥機(jī)制尚不明確,ER的丟失和變異并不能完全解釋TAM抵抗。本課題的前期研究發(fā)現(xiàn),抗雌激素藥物——他莫昔芬調(diào)節(jié)Cerb B-2基因表達(dá),繼而調(diào)節(jié)乳腺腫瘤細(xì)胞生長。在此過程中,有兩個基因:PAX2(配對盒基因,Paired box gene)及AIB-1(Amplified in breast cancer 1,又稱SRC-3)起到很重要的介導(dǎo)作用。研究發(fā)現(xiàn)PAX-2與AIB-1競爭性結(jié)合ER受體以調(diào)控HER-2的轉(zhuǎn)錄,從而決定他莫昔芬對乳腺癌內(nèi)分泌治療的有效性。鑒于此,本文對PAX2和AIB1在雌激素受體陽性的乳腺癌細(xì)胞生長及他莫昔芬耐藥中的作用進(jìn)行了較為系統(tǒng)的實驗研究。方法:1 PAX-2、AIB-1基因重組質(zhì)粒穩(wěn)定轉(zhuǎn)染MCF-7細(xì)胞株的建立1.1細(xì)胞穩(wěn)定轉(zhuǎn)染:將PAX-2、AIB-1基因的重組質(zhì)粒(EX-Z4450-M90(PAX-2)、EX-Z5301-M90(AIB-1))大量提純。通過脂質(zhì)體介導(dǎo)的方法將質(zhì)粒轉(zhuǎn)染入人乳腺癌MCF-7細(xì)胞,經(jīng)嘌呤霉素加壓篩選4-5周,分別得到穩(wěn)定高表達(dá)PAX-2、AIB-1基因的新乳腺癌細(xì)胞株(命名為MCF-7-PAX-2、MCF-7-AIB-1)。設(shè)立陰性質(zhì)粒[EX-NEG-M90(空載)]穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的MCF-7細(xì)胞株為對照(命名為MCF-7-空載)。通過綠色熒光蛋白GFP檢測細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率。1.2穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株的驗證:實驗分組:未處理組(MCF-7細(xì)胞);空載組(MCF-7-空載);對照組1(MCF-7-AIB1);對照組2(MCF-7-PAX2)。采用RT-PCR、Western blot方法分別檢測四組細(xì)胞株P(guān)AX2m RNA、AIB1m RNA及PAX2、AIB1蛋白表達(dá)量,以驗證獲得的細(xì)胞株為穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株。2穩(wěn)定轉(zhuǎn)染后細(xì)胞的體內(nèi)增殖能力及耐藥性的研究2.1穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞荷瘤裸鼠模型的建立和腫瘤體積的測量將穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞制備成單細(xì)胞懸液,于裸鼠于右側(cè)背部皮下注射細(xì)胞懸液,使接種細(xì)胞總數(shù)為1.5×107個/只。接種后觀察到腫瘤生長,按公式計算腫瘤體積(Tumor Volume)TV=1/2×LW2。待接種7周后給予他莫昔芬灌胃,觀察處理后腫瘤生長情況。2.2裸鼠成瘤標(biāo)本檢測接種12周后處死小鼠,取出皮下腫瘤,HE染色結(jié)果證實為接種瘤。同時,提取裸鼠腫瘤組織總RNA和總蛋白,進(jìn)行Western Blot和Real time PCR檢測PAX2、AIB1、HER2及增殖相關(guān)因子ki-67的表達(dá)情況。應(yīng)用免疫組化對PAX2、AIB1、HER-2、ki-67特異性表達(dá)情況進(jìn)行檢測。3統(tǒng)計學(xué)分析每組實驗不少于3次獨(dú)立樣本的重復(fù),采用SPSS軟件(13.0)進(jìn)行單因素方差分析(analysis of variance,ANOVA)和非參數(shù)檢驗,數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示,檢驗以P0.05為差異有顯著性意義。結(jié)果:1質(zhì)粒提純情況①提純的EX-Z4450-M90(PAX-2)、EX-Z5301-M90(AIB-1)、EX-NEG-M90(空載)質(zhì)粒進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳,獲得約與目的大小一致的條帶。②紫外分光光度儀法測定EX-Z4450-M90(PAX-2)、EX-Z5301-M90(AIB-1)、EX-NEG-M90(空載)質(zhì)粒濃度分別為684μg/ml,OD260/OD280值為1.956;598μg/ml,OD260/OD280值為1.942;962μg/ml,OD260/OD280值為1.959。質(zhì)粒提純成功,純度高,濃度高,可用于細(xì)胞轉(zhuǎn)染。③提純質(zhì)粒進(jìn)行檢測,質(zhì)粒所測部分堿基序列無錯誤。2轉(zhuǎn)染效率通過綠色熒光蛋白GFP檢測,MCF-7-PAX-2細(xì)胞、MCF-7-AIB-1細(xì)胞、MCF-7-空載細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率均達(dá)80%左右。3穩(wěn)轉(zhuǎn)株P(guān)AX2、AIB1基因m RNA表達(dá)情況RT-PCR結(jié)果顯示:與未處理組相比,MCF-7-PAX-2細(xì)胞PAX-2mRNA明顯升高,升高至321.08倍(P0.05);AIB-1 m RNA無明顯變化。MCF-7-AIB-1細(xì)胞AIB-1 m RNA明顯升高,599.665倍(P0.05);PAX-2m RNA無明顯變化。MCF-7-空載細(xì)胞PAX-2m RNA、AIB-1 m RNA均無明顯變化。4穩(wěn)轉(zhuǎn)株P(guān)AX2、AIB1蛋白表達(dá)情況Western blot結(jié)果顯示:與未處理組相比,MCF-7-PAX-2細(xì)胞PAX-2蛋白相對表達(dá)量為1.677±0.346,明顯升高,升高了67.7%(P0.05);AIB-1蛋白相對表達(dá)量為1.162±0.145,無明顯變化。MCF-7-AIB-1細(xì)胞AIB-1蛋白相對表達(dá)量為2.446±1.207,明顯升高,升高了144.56%(P0.05);PAX-2蛋白相對表達(dá)量為1.059±0.030,無明顯變化。MCF-7-空載細(xì)胞PAX-2蛋白相對表達(dá)量為1.035±0.040,AIB-1蛋白相對表達(dá)量為1.172±0.258均無明顯變化(P0.05)。5瘤體積測量結(jié)果:①接種3周后四組小鼠均形成腫瘤。②接種5周后,各組間瘤體積即出現(xiàn)明顯區(qū)別。與未處理組相比,MCF-7-PAX-2組腫瘤明顯小于未處理組,瘤體積小于7.36%(P0.05);MCF-7-AIB-1組腫瘤明顯大于未處理組,瘤體積大于13.09%(P0.05);而MCF-7-空載組和未處理組相比差異無顯著性(P0.05)。③接種7周后,與未處理組相比,MCF-7-PAX-2組腫瘤體積為876.76±48.11,明顯小于未處理組,瘤體積小于15.69%(P0.05);MCF-7-AIB-1組腫瘤體積為1596.99±64.97,明顯大于未處理組,瘤體積大于53.57%(P0.05);而MCF-7-空載組腫瘤體積為1101.99±93.3,與未處理組相比差異無顯著性(P0.05)。④他莫昔芬灌胃5周后,與處理組相比,MCF-7-PAX-2組腫瘤生長速度明顯小于未處理組,27.5%(P0.05);MCF-7-AIB-1組腫瘤生長速度明顯大于未處理組,125.75%(P0.05);而MCF-7-空載組和未處理組相比差異無顯著性(P0.05)。6接種瘤HE和免疫組化結(jié)果:①HE染色觀察實驗組和未處理組細(xì)胞形成的皮下腫瘤組織惡性程度無明顯差異,均可見高分裂像,瘤細(xì)胞排列密集形狀近于卵圓形或多邊形。②免疫組化顯示,四組腫瘤PAX-2、AIB-1、HER-2、ki-67均為陽性。與未處理組相比,MCF-7-PAX-2組腫瘤PAX-2強(qiáng)陽性表達(dá)率高(P0.05),HER2強(qiáng)陽性表達(dá)率低(p0.05),AIB-1、Ki-67均無顯著差異(P0.05);MCF-7-AIB-1組腫瘤AIB-1強(qiáng)陽性表達(dá)率高(p0.05),HER2、PAX-2、ki-67均無顯著差異(P0.05);而MCF-7-空載細(xì)胞和未處理組相比差異無顯著性P0.05)。7接種瘤RT-PCR結(jié)果顯示:與未處理組相比,MCF-7-PAX-2組腫瘤PAX-2m RNA明顯升高,升高13315.24%(P0.05),AIB-1m RNA、HER2m RNA顯著降低,分別降低67.16%、54.63%(P0.05);MCF-7-AIB-1組腫瘤AIB-1 m RNA、HER2m RNA明顯升高,分別升高5801.77%、538.49%(P0.05),PAX-2m RNA顯著降低,降低28.9%(P0.05);MCF-7-空載組腫瘤PAX-2m RNA、AIB-1m RNA、HER2m RNA和未處理組相比差異無顯著性(P0.05)。8接種瘤Western blot結(jié)果顯示:與未處理組相比,MCF-7-PAX-2組腫瘤PAX-2陽性表達(dá)率升高91.06%(P0.05),AIB-1、HER2陽性表達(dá)率分別降低33.86%、38.65%(P0.05),Ki-67均無顯著差異(P0.05);MCF-7-AIB-1組腫瘤AIB-1、HER2陽性表達(dá)率分別升高256.71%、270.23%(P0.05),PAX-2陽性表達(dá)率降低71.72%(P0.05),Ki-67無顯著差異(P0.05);MCF-7-空載腫瘤組PAX-2、AIB-1、HER2表達(dá)情況和未處理組相比差異無顯著性(P0.05)。結(jié)論:1 AIB-1高表達(dá)可促進(jìn)ER陽性乳腺癌MCF-7細(xì)胞在體內(nèi)的生長,PAX-2高表達(dá)可抑制MCF-7細(xì)胞在體內(nèi)的生長。2 AIB-1高表達(dá)可導(dǎo)致ER陽性乳腺癌MCF-7細(xì)胞對于TAM的敏感性降低,PAX-2高表達(dá)可促進(jìn)MCF-7細(xì)胞對于TAM的藥物敏感性。3 AIB-1高表達(dá)可促進(jìn)HER-2的表達(dá),PAX-2高表達(dá)可抑制HER-2的表達(dá)。4 AIB-1高表達(dá)或PAX-2高表達(dá)均不影響ki-67的表達(dá)。5 PAX-2高表達(dá)及AIB-1低表達(dá)均有助于改善TAM藥物療效和耐藥狀態(tài);預(yù)示了AIB-1和PAX-2可能作為乳腺癌內(nèi)分泌治療療效及耐藥的預(yù)測指標(biāo);并可成為TAM耐藥患者新的基因治療靶點(diǎn)。
【關(guān)鍵詞】：AIB-1 PAX-2 HER2 重組質(zhì)粒 穩(wěn)定轉(zhuǎn)染 MCF-7細(xì)胞 細(xì)胞增殖 三苯氧胺耐藥
【學(xué)位授予單位】：河北醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R737.9
【目錄】：

• 中文摘要4-9
• 英文摘要9-15
• 英文縮寫15-17
• 前言17-18
• 材料與方法18-37
• 1 材料18-23
• 2 方法23-37
• 結(jié)果37-40
• 1 質(zhì)粒提純情況37
• 2 轉(zhuǎn)染效率37
• 3 穩(wěn)轉(zhuǎn)株 PAX2、AIB1 基因 mRNA 表達(dá)情況37-38
• 4 穩(wěn)轉(zhuǎn)株 PAX2、AIB1 蛋白表達(dá)情況38
• 5 瘤體積測量結(jié)果38
• 6 接種瘤 HE 和免疫組化結(jié)果38-39
• 7 接種瘤 RT-PCR 結(jié)果顯示39
• 8 接種瘤 Western blot 結(jié)果顯示39-40
• 附圖40-54
• 附表54-60
• 討論60-64
• 結(jié)論64
• 參考文獻(xiàn)64-69
• 綜述 類固醇受體共激活因子 3 —— 一個潛在的癌癥治療的分子靶點(diǎn)69-86
• 參考文獻(xiàn)75-86
• 致謝86-87
• 個人簡歷87

【共引文獻(xiàn)】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 方紅;夏超;;男性乳腺癌6例臨床分析[J];安徽醫(yī)學(xué);2011年01期

2 湯曉敏;楊菊萍;張俊祥;余松濤;高之振;;乳腺浸潤性導(dǎo)管癌58例全數(shù)字化X線征象分析[J];蚌埠醫(yī)學(xué)院學(xué)報;2010年12期

3 周銳;王圣應(yīng);高之振;;鉬靶X線術(shù)前定位活檢在觸診陰性乳腺病變中的應(yīng)用[J];蚌埠醫(yī)學(xué)院學(xué)報;2011年12期

4 謝小紅;洪日;趙虹;樓麗華;;溫通法治療乳腺囊腫繼發(fā)感染臨床觀察[J];浙江中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報;2010年05期

5 杜長征;李惠平;侯寬永;李強(qiáng);趙紅梅;王墨培;;中國乳腺癌婦女表皮生長因子受體-2表達(dá)的Meta分析[J];北京大學(xué)學(xué)報(醫(yī)學(xué)版);2006年02期

6 鄭興斌;陳曉嬌;;孕激素受體的表達(dá)與局部晚期乳腺癌TC化療方案敏感性的觀察[J];重慶醫(yī)學(xué);2009年22期

7 田陽斌;馮選明;唐永仙;;上皮鈣依賴黏附素和β-連環(huán)蛋白在乳腺髓樣癌中的表達(dá)及其預(yù)后研究[J];重慶醫(yī)學(xué);2010年24期

8 潘永軍;沈廣洪;鄒曉瑜;;卡培他濱或吉西他濱聯(lián)合順鉑治療耐藥轉(zhuǎn)移性乳腺癌的臨床觀察[J];重慶醫(yī)學(xué);2012年08期

9 呂金梅;;ER PR及Her-2在乳腺癌中的表達(dá)及預(yù)后分析[J];長治醫(yī)學(xué)院學(xué)報;2010年04期

10 吳惠芳;;影響乳腺癌根治術(shù)后患側(cè)上肢功能康復(fù)的原因分析與護(hù)理對策[J];當(dāng)代護(hù)士(學(xué)術(shù)版);2011年05期

中國重要會議論文全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 王慧敏;;乳腺癌患者心理干預(yù)及護(hù)理[A];吉林省護(hù)理學(xué)會外科學(xué)護(hù)理分會第十五次學(xué)術(shù)會議論文匯編[C];2011年

2 吳加花;;局部晚期乳腺癌動脈介入TAC方案化療的護(hù)理要點(diǎn)[A];第七屆全國中西醫(yī)結(jié)合圍手術(shù)期醫(yī)學(xué)專題研討會全國中西醫(yī)結(jié)合圍手術(shù)期快速康復(fù)新進(jìn)展培訓(xùn)班廣東省中醫(yī)藥學(xué)會外科學(xué)會會議論文集[C];2012年

3 田柳;劉新美;江光霞;熊黎;;乳管鏡下藥物沖洗治療乳管滲出性疾病的體會[A];第十二次全國中醫(yī)、中西醫(yī)結(jié)合乳房病學(xué)術(shù)會議論文集[C];2011年

4 卓睿;;局部晚期乳腺癌新輔助化療后即時擴(kuò)展型背闊肌肌皮瓣乳房再造的探討[A];第十二次全國中醫(yī)、中西醫(yī)結(jié)合乳房病學(xué)術(shù)會議論文集[C];2011年

5 雷睿;司徒紅林;;超聲引導(dǎo)下穿刺抽液治療乳腺囊腫的臨床探討[A];第十二次全國中醫(yī)、中西醫(yī)結(jié)合乳房病學(xué)術(shù)會議論文集[C];2011年

6 劉佩芳;鮑潤賢;王琦;;規(guī)范乳腺M(fèi)RI檢查適應(yīng)證、檢查技術(shù)和診斷[A];第二屆全國乳腺影像診斷與技術(shù)應(yīng)用研討會暨學(xué)習(xí)班論文匯編[C];2007年

7 任黎萍;張曉清;;歸脾湯和龜鹿二仙湯加減治療乳腺癌化療后骨髓抑制50例臨床觀察[A];第十一屆全國中醫(yī)及中西醫(yī)結(jié)合乳腺病學(xué)術(shù)會議論文集[C];2009年

8 郭曉敏;孫慶穎;孫貽安;;乳腺癌化療后骨髓抑制的中醫(yī)藥輔助治療[A];第十一屆全國中醫(yī)及中西醫(yī)結(jié)合乳腺病學(xué)術(shù)會議論文集[C];2009年

9 許銳;;乳腺癌患者的生育問題[A];第十一屆全國中醫(yī)及中西醫(yī)結(jié)合乳腺病學(xué)術(shù)會議論文集[C];2009年

10 薛曉紅;;從163側(cè)乳頭溢液分析乳衄的辨病論治[A];第十一屆全國中醫(yī)及中西醫(yī)結(jié)合乳腺病學(xué)術(shù)會議論文集[C];2009年

中國博士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 魯志波;醫(yī)學(xué)圖像增強(qiáng)與插值的算法研究[D];解放軍信息工程大學(xué);2007年

2 葉兆祥;中國部分地區(qū)乳腺癌篩查分析及各種篩查方法比較研究[D];天津醫(yī)科大學(xué);2011年

3 賀青卿;乳腺癌淋巴引流途徑及內(nèi)乳淋巴結(jié)切除術(shù)的臨床研究[D];第三軍醫(yī)大學(xué);2006年

4 高德宗;γ-干擾素與他莫昔芬聯(lián)合抗乳腺癌作用及其機(jī)制的實驗研究[D];山東大學(xué);2006年

5 金雪瑛;Apigenin對人乳腺癌細(xì)胞VEGF表達(dá)的影響及相關(guān)作用通路[D];中國醫(yī)科大學(xué);2007年

6 羅婷;人乳腺癌中小鼠乳腺腫瘤病毒基因序列的表達(dá)及其與CerbB-2、p53、ER和PR的相關(guān)性研究[D];四川大學(xué);2007年

7 楊蓉;浸潤性乳腺癌的生活環(huán)境因素及癌組織中IGF2的表達(dá)[D];華中科技大學(xué);2008年

8 聶建云;組蛋白去乙�；{(diào)控對乳腺癌細(xì)胞增殖周期影響的研究[D];昆明醫(yī)學(xué)院;2010年

9 梁金龍;應(yīng)用iTRAQ技術(shù)分析絕經(jīng)前后三陰性乳腺癌和癌旁組織差異表達(dá)蛋白[D];吉林大學(xué);2013年

10 關(guān)若丹;中醫(yī)周期療法降低乳腺癌癌前病變?nèi)橄侔┌l(fā)生風(fēng)險的研究[D];廣州中醫(yī)藥大學(xué);2013年

中國碩士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 張芬;96例女性乳腺癌患者術(shù)后生存分析[D];山東中醫(yī)藥大學(xué);2010年

2 閆雷;保乳術(shù)后調(diào)強(qiáng)放療方法的劑量學(xué)研究[D];吉林大學(xué);2011年

3 黃勝;局部晚期乳腺癌新輔助化療不同化療方案（TAC組，TA組，TC組，F(xiàn)AC組）療效研究[D];昆明醫(yī)學(xué)院;2011年

4 李倩;中醫(yī)藥對鞏固期三陰乳腺癌療效的初步研究[D];廣州中醫(yī)藥大學(xué);2011年

5 李燕青;心理干預(yù)對乳腺癌化療患者疾病不確定感及應(yīng)對方式的影響[D];蘭州大學(xué);2011年

6 張魯燕;乳腺癌家族史對乳腺癌臨床病理及預(yù)后的影響[D];新疆醫(yī)科大學(xué);2011年

7 王永兵;XRCC1基因單核苷酸多態(tài)性與漢族、維吾爾族乳腺癌臨床病理參數(shù)的研究[D];新疆醫(yī)科大學(xué);2011年

8 劉志強(qiáng);新疆維、漢女性三陰性乳腺癌臨床病理特征分析[D];新疆醫(yī)科大學(xué);2011年

9 李爽;早期乳腺癌保乳術(shù)后復(fù)發(fā)風(fēng)險因素的探索及其預(yù)后評估[D];復(fù)旦大學(xué);2010年

10 薛曉蕾;數(shù)字乳腺X線導(dǎo)絲定位技術(shù)在不可觸及乳腺病變的應(yīng)用[D];天津醫(yī)科大學(xué);2011年

，

本文編號：808761